在誤 判所述雜株品種的概率< 〇. 1% ;在所述雜株品種為10個(gè)且真實(shí)雜株率僅超過判斷特異性 時(shí)所選用的閾值的10%時(shí)，由所述高通量測序的深度CF決定的對穩(wěn)定性與一致性的判定 結(jié)論正確的概率彡95.0%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述測試區(qū)域還包括非通用測試區(qū)域，所 述引物還包括非通用測試區(qū)域引物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述非通用測試區(qū)域引物包括第一引物 和第二引物，所述第一引物包括第一正向引物和第一反向引物，所述第二引物包括第二正 向引物和第二反向引物，所述第一引物和所述第二引物分別進(jìn)行單獨(dú)擴(kuò)增得到兩個(gè)所述非 通用測試區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物，將兩個(gè)所述非通用測試區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物等量混合用于構(gòu)建單獨(dú) 擴(kuò)增的高通量測序文庫； 所述第一正向引物的5'端連接有如序列表中SEQ ID NO: 1所示的序列1，所述第一反 向引物中的5'端連接有如序列表中SEQ ID N0:2所示的序列2 ; 所述第二正向引物的5'端連接有如序列表中SEQ ID N0:2所示的序列2,所述第二反 向引物的5'端連接有如序列表中SEQ ID NO: 1所示的序列1。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，利用所述變異位點(diǎn)、所述變異位點(diǎn)率和所 述雜株率，判斷所述待測玉米品種特異性、一致性和穩(wěn)定性的方法包括： 當(dāng)所述變異位點(diǎn)率多SD或所述非通用測試區(qū)域存在所述變異位點(diǎn)時(shí)，所述待測玉米 品種具有特異性，當(dāng)所述變異位點(diǎn)率< SD且所述變異位點(diǎn)不存在于所述非通用測試區(qū)域 時(shí)，所述待測玉米品種不具有特異性，其中SD為判斷特異性時(shí)所選用的閾值； 當(dāng)所述待測玉米品種的所述雜株率< M時(shí)，所述待測玉米品種具有一致性和穩(wěn)定性， 當(dāng)所述待測玉米品種的所述雜株率大于>1時(shí)，所述待測玉米品種不具有一致性和穩(wěn)定 性，M為判斷所述一致性和穩(wěn)定性時(shí)所選用的閾值； 所述雜株率R = Rl+R2-R3-R4+Rm，其中：
-，其中，nl為細(xì)胞核雜株品種的數(shù)目，tl為 ) 第il個(gè)所述細(xì)胞核雜株品種的所有特異雜株核基因型的數(shù)目，iljl為第il個(gè)所述細(xì)胞核 雜株品種的所有所述特異雜株核基因型按頻率由低到高排序后，第jl個(gè)所述特異雜株核 基因型，Rliljl為第iljl個(gè)所述特異雜株核基因型的頻率；R1為由雜株核基因型計(jì)算的所 述細(xì)胞核雜株品種的所述雜株率的總和，所述細(xì)胞核雜株品種的雜株率為去掉所述細(xì)胞核 雜株品種中最低的80%和最尚的10%的所述特異雜株核基因型的頻率后，剩余的所述特 異雜株核基因型的頻率的平均值的2倍；
，其中，t2為除所述細(xì)胞核雜株品種擁有的所述雜 株核基因型之外的且頻率多〇. 17%的所述雜株核基因型的數(shù)目，i2為除所述細(xì)胞核雜株 品種擁有的所述雜株核基因型之外的所有所述雜株核基因型按頻率由低到高排序后，第i2 個(gè)所述雜株核基因型，R2i2為第i2個(gè)所述雜株核基因型的頻率；R2是利用除所述細(xì)胞核雜 株品種擁有的所述雜株核基因型計(jì)算的所述雜株率，R2為去掉除所述細(xì)胞核雜株品種擁有 的所述雜株核基因型的頻率中最低的80%和最高的10%的值后，剩余值的平均值的2倍；
其中，n2為細(xì)胞質(zhì)雜株品種的數(shù)目，R3i3 為第i3個(gè)所述細(xì)胞質(zhì)雜株品種的雜株率，t3為第i3個(gè)所述細(xì)胞質(zhì)雜株品種的所有特異雜 株質(zhì)基因型的數(shù)目，i3j3為第i3個(gè)所述細(xì)胞質(zhì)雜株品種的所有所述特異雜株質(zhì)基因型按 頻率由低到高排序后，第j3個(gè)所述特異雜株質(zhì)基因型，R3i3j3為第i3j3個(gè)所述特異雜株 質(zhì)基因型的頻率；R3為由雜株質(zhì)基因型計(jì)算的所述細(xì)胞質(zhì)雜株品種的所述雜株率的總和， 所述細(xì)胞質(zhì)雜株品種的雜株率為去掉所述細(xì)胞質(zhì)雜株品種中最低的80%和最高的10%的 所述特異雜株質(zhì)基因型的頻率后，剩余的所述特異雜株質(zhì)基因型的頻率的平均值；
，其中，t4為除所述細(xì)胞質(zhì)雜株品種擁有的所述雜 株質(zhì)基因型之外的且頻率多0. 17%的所述雜株質(zhì)基因型的數(shù)目，i4為除所述細(xì)胞質(zhì)雜株 品種擁有的所述雜株質(zhì)基因型之外的所有所述雜株質(zhì)基因型按頻率由低到高排序后，第i4 個(gè)所述雜株質(zhì)基因型，R4i4為第i4個(gè)所述雜株質(zhì)基因型的頻率；R4是利用除所述細(xì)胞質(zhì)雜 株品種擁有的所述雜株質(zhì)基因型計(jì)算的雜株率，R4為去掉除所述細(xì)胞質(zhì)雜株品種擁有的所 述雜株質(zhì)基因型的頻率中最低的80%和最高的10%的值后，剩余值的平均值；
實(shí)中，t5為雜種特異測試區(qū)域的數(shù)目；i5為第i5個(gè)所述雜種 特異測試區(qū)域；Rmi5為第i5個(gè)所述雜種特異測試區(qū)域中，母本基因型的頻率；Rfi5為第i5 個(gè)所述雜種特異測試區(qū)域中，父本基因型的頻率；Rm為母本自交的所述雜株率，Rm為所述 雜種特異測試區(qū)域中，所述母本基因型的頻率與所述父本基因型的頻率的差值的平均值； Int()為取整函數(shù)； 所述細(xì)胞核雜株品種是指僅利用核基因型計(jì)算獲得的所述雜株品種，所述細(xì)胞質(zhì)雜株 品種是指僅利用質(zhì)基因型計(jì)算獲得的所述雜株品種；所述特異雜株核基因型是指僅為一個(gè) 所述細(xì)胞核雜株品種所有的所述雜株核基因型；所述特異雜株質(zhì)基因型是指僅為一個(gè)所述 細(xì)胞質(zhì)雜株品種所有的所述雜株質(zhì)基因型；所述雜株核基因型是指所述雜株基因型為所述 核基因型；所述雜株質(zhì)基因型是指所述雜株基因型為所述質(zhì)基因型；在所述雜種特異測試 區(qū)域中，所述母本基因型與所述父本基因型不相同，所述母本基因型與所有所述細(xì)胞核雜 株品種的基因型不同，且所述父本基因型與所有所述細(xì)胞核雜株品種的基因型也不同；所 述母本基因型為所述待測玉米品種中，與母本的基因型相同的基因型；所述父本基因型為 所述待測玉米品種中，與父本的基因型相同的基因型； 所述核基因型指位于細(xì)胞核基因組上的基因型；所述質(zhì)基因型是指位于細(xì)胞質(zhì)基因組 上的基因型。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法還包括采用以下方式判 定所述待測玉米品種的一致性和穩(wěn)定性的結(jié)論正確的概率為：當(dāng)所述待測玉米品種 具有一致性和穩(wěn)定性時(shí)，結(jié)論正確的概率彡BINOM. DIST (M*SN，SN，R，TRUE) *BIN0M. DIST(SeN*M，SeN，R，TRUE);當(dāng)所述待測玉米品種不具有所述一致性和穩(wěn)定 性時(shí)，結(jié)論正確的概率彡8預(yù)0^015!'((1-]\〇蠔151(1-1〇，11?耶)祁預(yù)0^ DIST(SeN*(l-M)，SeN，1-R，TRUE);其中，M為判斷所述一致性和穩(wěn)定性時(shí)所選用的閾值， SeN為所有用于計(jì)算所述雜株率R的基因型的頻率所在所述測試區(qū)域的測序片段的總和， BINOM. DIST(M*SN，SN，R，TRUE)為所述待測玉米品種進(jìn)行了 SN次抽樣，實(shí)際抽得的所述 雜株率R小于所述閾值M的概率，BINOM. DIST(SeN*M，SeN，R，TRUE)的意義為：對所述待 測玉米品種進(jìn)行了 SeN次抽樣，實(shí)際抽得的所述雜株率R小于閾值M的概率；BINOM. DIS T((1-M)*SN，SN，（1-R)，TRUE)為所述待測玉米品種進(jìn)行了 SN次抽樣，實(shí)際抽得的所述雜株 率R大于所述閾值M的概率，BINOM. DIST (SeN* (1-M)，SeN，1-R，TRUE)的意義為：對所述待 測玉米品種進(jìn)行了 SeN次抽樣，實(shí)際抽得的所述雜株率R大于閾值M的概率，所述基因型的 頻率是指所述測序片段組中，代表所述基因型的測序片段數(shù)占所述基因型所在所述測試區(qū) 域的測序片段總數(shù)的比例。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，當(dāng)所述非通用測試區(qū)域不存在 所述變異位點(diǎn)時(shí)，若判斷所述待測玉米品種具有特異性，結(jié)論正確的概率多BIN0M. DIST((1-SD)*TRN，TRN，1-OD，TRUE);若判斷所述待測玉米品種不具有特異性，結(jié)論正確的 概率彡BINOM. DIST (SD*TRN，TRN，OD，TRUE)，其中，TRN為檢測成功的測試區(qū)域的數(shù)目，0D為 所述變異位點(diǎn)率，BINOM. DIST為exCel2010中的函數(shù)，所述結(jié)論正確的概率表示為當(dāng)判斷 所述待測玉米品種具有特異性時(shí)，所述變異位點(diǎn)率大于SD的概率，當(dāng)判斷所述待測玉米品 種不具有特異性時(shí)，所述變異位點(diǎn)率小于SD的概率，所述檢測成功的測試區(qū)域通過分析所 述測序片段組后獲得。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，獲得所述雜株品種的方法包括：所述雜株 品種為存在于所述數(shù)據(jù)庫中的品種，且所述雜株品種的潛在雜株基因型與所述雜株基因型 間有相同基因型的所述測試區(qū)域的數(shù)目占所述雜株品種具有所述潛在雜株基因型的所述 測試區(qū)域的總數(shù)的比例彡60% ;所述雜株基因型指頻率彡0. 02%的所述潛在雜株基因型； 所述潛在雜株基因型與所述待測玉米品種的所有基因型間的差異堿基的數(shù)量多2個(gè) 或所述差異堿基中有非連續(xù)堿基的插入或缺失。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過所述變異位點(diǎn)確定所述通用測試區(qū) 域的方法為：通過區(qū)分5
4十算區(qū)分度的值，其中，a為變異窗口區(qū)域中被 檢測到的品種總數(shù)，bi為所述變異窗口區(qū)域中第i種基因型的品種數(shù)，且bi>l，k為包含大 于1個(gè)品種的基因型的數(shù)目，所述變異窗口區(qū)域?yàn)橐悦總€(gè)單核苷酸變異位點(diǎn)為中心，向所 述單核苷酸變異位點(diǎn)的兩側(cè)各延伸測序列長度的1/2作為檢測的窗口； 所述通用測試區(qū)域?yàn)榧?xì)胞質(zhì)基因組上區(qū)分度大的區(qū)域或細(xì)胞核基因組上所述區(qū)分度 大且均勻分布的區(qū)域。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測定雜交玉米新品種的特異性、一致性與穩(wěn)定性的方法。所述方法包括：獲得變異位點(diǎn)；確定待測玉米品種的測試區(qū)域；構(gòu)建數(shù)據(jù)庫；確定抽樣量后，隨機(jī)抽樣混合并提取混合樣本的DNA；制備引物；利用引物對混合樣本的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用于構(gòu)建高通量測序文庫；對高通量測序文庫進(jìn)行高通量測序，得到測序片段組；分析測序片段組，獲得待測玉米品種基因型和雜株基因型；比較獲得近似品種、變異位點(diǎn)和變異位點(diǎn)率；獲得雜株品種后，計(jì)算雜株率；利用變異位點(diǎn)、變異位點(diǎn)率和雜株率，判斷待測玉米品種特異性、一致性和穩(wěn)定性。所述方法能夠準(zhǔn)確、完整地判斷待測玉米品種的特異性、穩(wěn)定性與一致性，且測試速度更快。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104805190
【申請?zhí)枴緾N201510150506
【發(fā)明人】張靜, 彭海, 陳紅, 章偉雄
【申請人】江漢大學(xué), 農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年3月31日