噬菌體展示文庫(kù)及其應(yīng)用和制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種噬菌體展示 文庫(kù)、該文庫(kù)在篩選特異性識(shí)別靶抗原的抗體中的用途以及制備該文庫(kù)的方法；本發(fā)明還 涉及編碼該噬菌體展示文庫(kù)所展示的多肽的DNA組合物、用于構(gòu)建所述噬菌體展示文庫(kù)的 噬菌體質(zhì)粒組合物、含有該噬菌體質(zhì)粒組合物的宿主細(xì)胞庫(kù)、用于構(gòu)建所述噬菌體展示文 庫(kù)的引物及其用途以及包括所述噬菌體展示文庫(kù)的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基 因的適當(dāng)位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)，同時(shí)外源蛋白隨噬菌體的重新組裝 而展示到噬菌體表面的生物技術(shù)。噬菌體屬于單鏈DNA病毒，包括FI、fd和M13三類。噬 菌體DNA能夠在細(xì)菌內(nèi)滾環(huán)復(fù)制，細(xì)菌不被裂解，但生長(zhǎng)速度減慢，同時(shí)可分泌出大量成熟 的噬菌體顆粒。噬菌體的單鏈DNA長(zhǎng)約7000bp，不同類型的噬菌體的一級(jí)結(jié)構(gòu)極為相似，基 因組編碼11種蛋白質(zhì)，其中5種為結(jié)構(gòu)蛋白，與噬菌體展示密切相關(guān)的是二種不同的結(jié)構(gòu) 蛋白P III和p VIL噬菌體單鏈DNA被包裹在由大約2700-3000個(gè)主要衣殼蛋白p VDI組成的 管狀結(jié)構(gòu)中。另外，次要衣殼蛋白P III通過(guò)與大腸桿菌的F菌毛結(jié)合而引起感染，其是噬菌 體感染宿主所必需的。
[0003] 噬菌體展示平臺(tái)已經(jīng)發(fā)展成熟，其通過(guò)將目標(biāo)蛋白融合在pill蛋白基因中的適 當(dāng)位置，從而在噬菌體表面展示目標(biāo)蛋白（參見文獻(xiàn)"Bass, S.，Proteins, 8:309 (1990) ; L owman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)，'）。 由于融合有目標(biāo)基因的pin蛋白基因處于低表達(dá)狀態(tài)且野生型pin蛋白仍在表達(dá)，因 此能夠很好地維持噬菌體的感染性。與此相關(guān)的專利文獻(xiàn)如：美國(guó)專利No. 5, 723, 286、 美國(guó)專利No. 5, 432, 018、美國(guó)專利No. 5, 580, 717、美國(guó)專利No. 5, 427, 908和美國(guó)專利 No. 5, 498, 530。
[0004] 利用噬菌體文庫(kù)篩選針對(duì)靶蛋白、多肽或小分子的多肽或蛋白的技術(shù)已被廣泛研 究（參見文獻(xiàn) "Tonikian，R·，Nature protocols, 2:1368 (2007)"）。其基本思路為：將設(shè)計(jì) 好的噬菌體文庫(kù)與固相上的靶蛋白分子經(jīng)過(guò)一定時(shí)間孵育后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體， 然后以競(jìng)爭(zhēng)受體或酸洗脫下與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體，用洗脫的噬菌體感染宿主細(xì)胞， 之后繁殖擴(kuò)增，進(jìn)行下一輪孵育洗脫，經(jīng)過(guò)3輪~5輪的"吸附-洗脫-擴(kuò)增"后，與靶分子 特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集。通過(guò)噬菌體ELI SA，可從富集噬菌體輸出文庫(kù)中挑選出來(lái) 具有期望結(jié)合特性的單克隆噬菌體。
[0005] 噬菌體展示技術(shù)可以產(chǎn)生包含101°種以上不同展示蛋白的文庫(kù)，這與人體所 能產(chǎn)生的抗體總數(shù)相近，從而使基于此技術(shù)的抗體篩選成為可能。然而，由于抗體的互 補(bǔ)決定區(qū)全部可隨機(jī)產(chǎn)生1〇 7°種以上的變化，因此，科學(xué)地設(shè)計(jì)抗體的噬菌體展示文庫(kù) 將是決定篩選成功率和效率的關(guān)鍵因素。在這方面，已經(jīng)有很多研究成果(例如，參見文 獻(xiàn)"TomLinson，Nature Biotech. (2000)，18:989-994，，、"Barbas，PNAS9113809 (1994)，，、 " Yelton，D E，J. Immunology, 15511994(1995)，'、" Jackson，J. R.，J. Immunology, 15413310(1995)" 和 "Hawkins, R E, J. Mol. Biology, 2261889(1992)"）。
[0006] 但以上研究針對(duì)的是常規(guī)抗體的篩選，所得抗體針對(duì)的表面決定簇隨機(jī)，并且對(duì) 抗原的功能性、致病性點(diǎn)突變不敏感、無(wú)法識(shí)別；并且在構(gòu)建噬菌體文庫(kù)時(shí)，通常需要首先 經(jīng)過(guò)免疫動(dòng)物的步驟，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。
[0007] 美國(guó)專利文獻(xiàn)No. 7985840B2和No. 2013/0244883A1公開了一種噬菌體文庫(kù)，以及 制備該噬菌體文庫(kù)的方法。該方法對(duì)抗體CDR結(jié)構(gòu)域中的溶劑可及且多樣性的位點(diǎn)采用了 簡(jiǎn)并密碼子突變，從而不需進(jìn)行常規(guī)的免疫動(dòng)物等步驟即可達(dá)到足夠的多樣性。然而，這 些方法都沒(méi)有區(qū)分抗體中用于識(shí)別靶抗原的核心結(jié)合區(qū)和次要識(shí)別區(qū)，而是對(duì)輕鏈CDR1、 CDR2結(jié)構(gòu)域和重鏈CDRl、CDR2結(jié)構(gòu)域都采用了突變性較弱的弱隨機(jī)突變簡(jiǎn)并密碼子，只對(duì) 抗體輕鏈和重鏈CDR3結(jié)構(gòu)域采用了突變性較強(qiáng)的強(qiáng)隨機(jī)突變簡(jiǎn)并密碼子，并且該強(qiáng)隨機(jī) 突變簡(jiǎn)并密碼子包括終止密碼子。因此，該方法所制備的噬菌體文庫(kù)的多樣性對(duì)針對(duì)突變 抗原的抗體篩選沒(méi)有優(yōu)勢(shì)，并且由于其使用了包括終止密碼子的強(qiáng)隨機(jī)突變，該文庫(kù)所展 示的抗體中的穩(wěn)定性抗體的比例較低，這導(dǎo)致該噬菌體文庫(kù)的篩選效率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種噬菌體展示文庫(kù)、該文 庫(kù)在篩選特異性識(shí)別靶抗原的抗體中的用途以及制備該文庫(kù)的方法；本發(fā)明還涉及編碼該 噬菌體展示文庫(kù)所展示的多肽的DNA組合物、用于構(gòu)建所述噬菌體展示文庫(kù)的噬菌體質(zhì)粒 組合物、含有該噬菌體質(zhì)粒組合物的宿主細(xì)胞庫(kù)、用于構(gòu)建所述噬菌體展示文庫(kù)的引物及 其用途以及包括所述噬菌體展示文庫(kù)的試劑盒。
[0009] 具體而言，本發(fā)明提供了：
[0010] (1) 一種噬菌體展示文庫(kù)，包含一系列各自獨(dú)立地具有三維結(jié)構(gòu)的抗體性多肽，所 述多肽中的每一者均包含具有抗體性重鏈CDRl結(jié)構(gòu)域、抗體性重鏈CDR2結(jié)構(gòu)域和抗體性 重鏈CDR3結(jié)構(gòu)域的重鏈、以及具有抗體性輕鏈CDRl結(jié)構(gòu)域、抗體性輕鏈CDR2結(jié)構(gòu)域和抗 體性輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域的輕鏈，其特征在于：所述抗體性重鏈CDRUCDR2和CDR3結(jié)構(gòu)域以及 所述抗體性輕鏈CDRl、CDR2和CDR3結(jié)構(gòu)域都具有強(qiáng)隨機(jī)突變性位點(diǎn)，所述強(qiáng)隨機(jī)突變性位 點(diǎn)是位于所述多肽三維結(jié)構(gòu)表面上的用于結(jié)合靶抗原的且非保守性的位點(diǎn)，所述強(qiáng)隨機(jī)突 變性位點(diǎn)是由強(qiáng)隨機(jī)突變簡(jiǎn)并密碼子編碼的氨基酸，并且所述強(qiáng)隨機(jī)突變簡(jiǎn)并密碼子不包 括終止密碼子。
[0011] (2)根據(jù)（1)所述的噬菌體展示文庫(kù)，其中所述抗體性多肽的氨基酸序列采用 Chothia編號(hào)系統(tǒng)編號(hào)時(shí)，所述強(qiáng)隨機(jī)突變性位點(diǎn)為：所述抗體性重鏈CDRl結(jié)構(gòu)域的第33 位氨基酸，所述抗體性重鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域的第50、52、56、58位氨基酸，所述抗體性重鏈⑶R3 結(jié)構(gòu)域的第95至（95+k)位氨基酸，所述抗體性輕鏈CDRl結(jié)構(gòu)域的第30、31位氨基酸，所 述抗體性輕鏈CDR2結(jié)構(gòu)域的第50位氨基酸，以及所述抗體性輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域的第91至 (91+j)位氨基酸；其中k為3至14的整數(shù)，j為3至6的整數(shù)。
[0012] (3)根據(jù)（1)或（2)所述的噬菌體展示文庫(kù)，其中所述抗體性重鏈⑶R1、⑶R2和 CDR3結(jié)構(gòu)域以及所述抗體性輕鏈CDR1、CDR2和CDR3結(jié)構(gòu)域都具有弱隨機(jī)突變性位點(diǎn)，所 述弱隨機(jī)突變性位點(diǎn)是溶劑可及且非保守性的位點(diǎn)，其是由弱隨機(jī)突變簡(jiǎn)并密碼子編碼的 氨基酸，并且所述弱隨機(jī)突變簡(jiǎn)并密碼子不編碼破壞所述多肽三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的氨基酸。
[0013] (4)根據(jù)（3)所述的噬菌體展示文庫(kù)，其中所述弱隨機(jī)突變性位點(diǎn)各自所包括的氨 基酸包括：在天然鼠源抗體相應(yīng)位點(diǎn)處的出現(xiàn)頻率至少為65%的氨基酸和/或出現(xiàn)頻率之 和至少為65%的氨基酸。
[0014] (5)根據(jù)（3)所述的噬菌體展示文庫(kù)，其中所述抗體性多肽的氨基酸序列采用 Chothia編號(hào)系統(tǒng)編號(hào)時(shí)，
[0015] 所述抗體性重鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域包含連續(xù)氨基酸序列 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9,其中Xl至X9依次對(duì)應(yīng)所述Chothia編號(hào)系統(tǒng)的第27至第 35位，X7為由強(qiáng)隨機(jī)突變簡(jiǎn)并密碼子編碼的氨基酸中的任意一種，X