抗人ror1單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗人R0R1單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用，具體涉及一種人源 化的抗人R0R1單克隆抗體及其制備方法，以及所述單克隆抗體在癌細(xì)胞治療的示蹤和靶 向應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 受體酪氨酸激酶樣孤兒受體 _1(receptortyrosinekinase-likeorphan rec印tor，R0R1)蛋白最初是在20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)的，之所以被稱為孤兒受體，是因為其 功能未知。之后有研宄人員發(fā)現(xiàn)R0R1能在胚胎發(fā)育過程中高水平表達(dá)，并在胚胎肌肉和骨 骼發(fā)育調(diào)控中扮演了重要的角色。但是在接下來的胎兒發(fā)育過程中，這種蛋白的表達(dá)被關(guān) 閉了，成人正常細(xì)胞和組織中通常并不表達(dá)R0R1。但是，癌細(xì)胞是一個例外。
[0003] 在2008年，Kipps博士研宄組發(fā)現(xiàn)Wnt5a配體和R0R1相互作用可以提高白血病 細(xì)胞的生存能力。R0R1應(yīng)答產(chǎn)生的抗體可以阻礙機體生存信號，而且可以特異性地將這種 白血病細(xì)胞作為毀滅靶目標(biāo)。這項研宄還指出R0R1抗原僅僅在白血病細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，它可 以開發(fā)為一種癌癥沒有被檢測到的時候，白血病的鑒別或監(jiān)控治療后細(xì)胞存在狀態(tài)的特異 性標(biāo)記。
[0004] 在2012年，Kipps研宄組發(fā)表研宄報告在胚胎發(fā)育過程中表達(dá)的蛋白R0R1在許 多不同類型的癌癥中存在，但在正常產(chǎn)后組織中不表達(dá)。在這一基礎(chǔ)上，研宄人員進(jìn)行了 沉默實驗，他們在人類乳腺癌細(xì)胞中沉默了R0R1蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這減緩了癌細(xì)胞的生長速 度，并在實驗室和動物實驗中都得到了證實。
[0005]目前沒有針對R0R1的特異性抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種對人R0R1特異性的單克隆抗體。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供分泌表達(dá)抗R0R1的單克隆抗體的細(xì)胞株。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述抗R0R1的單克隆抗體的制備方法。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述抗R0R1的單克隆抗體的應(yīng)用。
[0010] 本案發(fā)明人經(jīng)大量實驗研宄，制得了一種抗人R0R1的單克隆抗體。本發(fā)明的單克 隆抗體是人源化的，其親和力已經(jīng)達(dá)到〇.InM的水平。這種高親和力的單克隆抗體在臨床 上具有重要的價值。
[0011] 具體而言，一方面，本發(fā)明提供了一種抗R0R1的人源化單克隆抗體，該抗體具有 重鏈可變區(qū)（VH)和輕鏈可變區(qū)（VL)，所述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)各自具有3個互補決定 區(qū)（CDR)，其中：重鏈可變區(qū)的CDR1的氨基酸序列為SEQIDN0:21或SEQIDN0:27,重鏈可 變區(qū)的0)1?2的氨基酸序列為5￡〇10勵:22或5￡〇10勵 :28，重鏈可變區(qū)的0)1?3的氨基酸 序列為SEQIDNO: 23或SEQIDNO: 29,輕鏈可變區(qū)的CDR1的氨基酸序列為SEQIDNO: 24 或SEQIDNO: 30,輕鏈可變區(qū)的CDR2的氨基酸序列為SEQIDNO: 25或SEQIDNO: 31，輕 鏈可變區(qū)的CDR3的氨基酸序列為SEQIDN0:26或SEQIDN0:32。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的單克隆抗體，所述重鏈可變區(qū)的CDR1~ 〇)1?的氨基酸序列分別為3￡0 10勵:21、3￡0 10勵:22、3￡0 10勵:23，或者分別為3￡0 10 N0:27、SEQIDN0:28、SEQIDN0:29 ;所述輕鏈可變區(qū)的CDR1~CDR3的氨基酸序列分別 為SEQIDN0:24、SEQIDN0:25、SEQIDN0:26,或者分別為SEQIDN0:30、SEQIDN0:31、 SEQIDN0:32。在本發(fā)明的一具體實施方案中，本發(fā)明的單克隆抗體，所述重鏈可變區(qū)的 〇?1~〇)1?3的氨基酸序列分別為5￡0 10勵:21、5￡0 10勵:22、5￡0 10勵:23，所述輕鏈 可變區(qū)的CDR1~CDR3的氨基酸序列分別為SEQIDN0:24、SEQIDN0:25、SEQIDN0:26。 在本發(fā)明的另一具體實施方案中，本發(fā)明的單克隆抗體，所述重鏈可變區(qū)的CDR1~CDR3的 氨基酸序列分別為SEQIDN0:27、SEQIDN0:28、SEQIDN0:29;所述輕鏈可變區(qū)的CDR1~ CDR3 的氨基酸序列分別為SEQIDNO: 30、SEQIDNO: 31、SEQIDNO: 32。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的單克隆抗體，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如 SEQIDN0 :1或SEQIDN0 :7所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDN0 :2或SEQID NO:8所示。根據(jù)本發(fā)明的一具體實施方案，本發(fā)明的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序 列如SEQIDN0 :1所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDN0 :2所示；本發(fā)明中，將該單 克隆抗體命名為1G8單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明的另一具體實施方案，本發(fā)明的單克隆抗體 的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDN0 :7所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDN0: 8所示；本發(fā)明中，將該單克隆抗體命名為3F4單克隆抗體。
[0014] 本發(fā)明中，進(jìn)一步地，在所述的重鏈可變區(qū)的氨基酸和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列 基礎(chǔ)上，在重鏈可變區(qū)（VH)的N端加上針對重鏈分泌表達(dá)優(yōu)化的信號肽序列，在VH的C端 加上人IgGl-Fc恒定區(qū)序列（CH1-CH3)，構(gòu)造出了重鏈全長的氨基酸序列。同時在輕鏈可變 區(qū)（VL)的N端加上輕鏈分泌表達(dá)優(yōu)化的信號肽序列，在VL的C端加上人Kappa恒定區(qū)序 列，構(gòu)造出輕鏈的全長氨基酸序列。即，根據(jù)本發(fā)明的一具體實施方案，本發(fā)明的單克隆抗 體的重鏈恒定區(qū)為人IgGl-Fc恒定區(qū)，輕鏈恒定區(qū)為人k鏈恒定區(qū)。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的一具體實施方案，本發(fā)明的單克隆抗體的重鏈和輕鏈的氨基酸序列 分別如SEQIDN0 :4和SEQIDN0 :6所示；該抗體為本發(fā)明的抗R0R1的人源化單克隆抗體 1G8的一具體示例。根據(jù)本發(fā)明的另一具體實施方案，本發(fā)明的單克隆抗體的重鏈和輕鏈的 氨基酸序列分別如SEQIDN0 :10和SEQIDN0 :12所示；該抗體為本發(fā)明的抗R0R1的人源 化單克隆抗體3F4的一具體示例。
[0016]另一方面，本發(fā)明還提供了一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼本發(fā)明所述的單克 隆抗體的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)，或者編碼所述單克隆抗體的重鏈和/或輕鏈。
[0017] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種分泌表達(dá)本發(fā)明所述的抗R0R1的人源化單克隆 抗體的細(xì)胞株。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的單克隆抗體表達(dá)細(xì)胞系是采用UC0E載體 技術(shù)及ClonePix單克隆篩選技術(shù)篩選得到的。更具體地，所述的分泌抗R0R1的人源化單 克隆抗體的細(xì)胞株是按照以下方法制備得到的：將帶有編碼本發(fā)明所述的抗體的重鏈的抗 體基因的表達(dá)載體、帶有編碼本發(fā)明所述的抗體的輕鏈的抗體基因的表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入大 腸桿菌DH5a菌株，進(jìn)行擴增培養(yǎng)，抽提純化質(zhì)粒DNA;其中，所述的表達(dá)載體優(yōu)選為UC0E 載體，構(gòu)建帶有抗體基因的表達(dá)載體的具體操作可以參照現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行；將所得純化的質(zhì) 粒DNA轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞；轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞使用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，并在半固體選擇培養(yǎng)基上進(jìn) 行稀釋，使用ClonePixFL進(jìn)行克隆挑選。優(yōu)選地，挑出多個單克隆細(xì)胞系在FreeStyle? CHO培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮化擴大培養(yǎng)，對上清進(jìn)行ELISA檢測抗體表達(dá)量，從中挑選培養(yǎng)過程 中抗體最高表達(dá)量在200mg/L以上的克隆，即為所述的細(xì)胞株。
[0019] 在本發(fā)明的一具體實施例中（參見實施例4)，本發(fā)明篩選得到多株能夠高表達(dá) 抗R0R1單克隆抗體的克隆作為本發(fā)明的細(xì)胞株，其中，這些細(xì)胞株分別命名為：1G8_5(本 發(fā)明中亦命名為 1G8-5C3)、1G8-2D1、1G8-6H4、1G8-2E10、1G8-3B9、3F4-2G7、3F4-5A6、 3F4-3D4、3F4-2C4、3F4-2A10。其中，1G8-5C3、1G8-2D1、1G8-6H4、1G8-2E10、1G8-3B9 能高 效地分泌表達(dá)本發(fā)明的抗R0R1的人源化單克隆抗體1G8 ; 3F4-2G7、3F4-5A6、3F4-3D4、 3F4-2C4、3F4-2A10能分泌表達(dá)本發(fā)明的抗R0R1的人源化單克隆抗體3F4。特別是，細(xì)胞株 1G8-5C3經(jīng)過簡單流加工藝培養(yǎng)后，單克隆抗體產(chǎn)量可高至2.lg/L，且抗體純度高（可達(dá) 100%)，并具有很高的親和力（達(dá)到O.lnM級別），極具產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景和價值。本發(fā)明的 細(xì)胞株1G8-5C3已于2015年4月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心（CGMCC)(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所），保藏 編號：CGMCCNo. 10583 ;分類命名：受體酪氨酸激酶樣孤兒受體-1人乳腺癌細(xì)胞。
[0020] 另一方面，本發(fā)明還提供了所述的抗R0R1的人源化單克隆抗體的制備方法，其包 括：培養(yǎng)本發(fā)明所述的分泌表達(dá)所述抗R0R1的人源化單克隆抗體的細(xì)胞株，收集細(xì)胞培養(yǎng) 液，離心，上清液經(jīng)0. 45ym過濾后進(jìn)ProteinA柱親和純化，得到抗R0R1的人源化單克隆 抗體。
[0021] 實驗證明，本發(fā)明的方法所制備得到的抗R0R1的人源化單克隆抗體，其產(chǎn)量高， 極具產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景和價值；且純度高（可高達(dá)98%以上）、親和力強（親和力可達(dá)到納米 級別甚至〇.InM級別），在臨床上具有重要的價值。
[0022] 具體地，細(xì)胞株的培養(yǎng)過程可以參照所屬領(lǐng)域中的相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行。本發(fā)明中 優(yōu)選采用Feedbatch補料流加培養(yǎng)方式。
[0023] 綜上所述，本發(fā)明采用UC0E載體技術(shù)及ClonePix單克隆篩選技術(shù)，篩選出一些單 克隆抗體表達(dá)細(xì)胞系，并據(jù)此提供了一種抗R0R1的人源化單克隆抗體及其制備方法與應(yīng) 用，本發(fā)明的單克隆抗體純度高、是人源化的，其親和力已經(jīng)達(dá)到〇.InM的水平，在臨床上 具有重要的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0024] 圖1 :1G8和3F4重鏈可變區(qū)與