煙草赤星病的人工接種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物保護領(lǐng)域的病菌接種方法，特別涉及煙草赤星病的人工接種方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草赤星病是由鏈格抱菌（AlternariaalternataFriesKeissler)引起的一種 葉部真菌病害，發(fā)生于煙草生長中后期，是煙草生產(chǎn)上威脅較大的病害之一。該病具有潛育 期短、流行速度快的特點，在適宜的環(huán)境條件下，短時間內(nèi)即可造成大流行，給煙葉生產(chǎn)帶 來巨大損失。自20世紀90年代以后，我國煙草赤星病的發(fā)生逐年上升，且愈趨嚴重，成為 主要的侵染性病害之一。因此，科學(xué)的控制赤星病是生產(chǎn)上亟待解決的問題。利用抗病品 種是防治煙草赤星病最為有效的措施，這就有必要確定赤星病病菌的致病性強弱及優(yōu)勢菌 群，并進行煙草種質(zhì)資源與品種抗病性鑒定與篩選工作。這其中就牽涉到快速、簡便、有效 的人工接種方法，
[0003] 因為依靠田間自然發(fā)病鑒定，調(diào)查困難，費時費力，周期長，而溫室接種試驗場地 較為費工，人工接種法可節(jié)省菌液、勞力、試材和設(shè)備，且環(huán)境條件可控、穩(wěn)定，不受干擾，接 種簡單、發(fā)病快速、結(jié)果更為準確可靠，因此探索出室內(nèi)人工接種赤星病菌的適宜方法，是 對快捷有效的測定病原菌的致病力及篩選赤星病抗病品種，具有很好的應(yīng)用價值。
[0004] 接種是證病過程的重要環(huán)節(jié)，是研宄赤星病病原致病性、發(fā)病規(guī)律、侵染途徑、品 種（材料）的抗性鑒定及控制病害等方面的有效保障，特別是在品種對煙草赤星病的抗性 研宄中，對所鑒定品種進行人工接菌誘發(fā)病害發(fā)生是品種抗性篩選研宄不可缺少的手段和 方法。目前，已報道的赤星病菌人工接種方法主要有菌絲塊接種法（董漢松，曲建軍，呂士 恩等.煙草赤星病菌孢子萌發(fā)和侵染條件的研宄山東科學(xué)1993(2) :30-35)、菌絲懸滴接 種法（沈奕，高智謀，杜雷等.煙草赤星病菌苗期人工接種方法的研宄安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 2009, 36(3) :356-359)、孢子懸滴法（張世才.重慶煙草赤星病菌的致病力分化及遺傳差異 性研宄.2009,西南大學(xué)碩士學(xué)位論文）、孢子液棉球法（成巨龍，孫渭.煙草不同發(fā)育階段 對赤星病的抗性表現(xiàn)與綜合防治技術(shù).植物保護學(xué)報2001，28(1):44-48)及噴霧法（焦天 雷?煙草（NicotianatabacumL.)赤星病抗性QTL的定位分析.2011，浙江大學(xué)碩士學(xué)位 論文）；但在試驗中發(fā)現(xiàn)，利用上述幾種不同方法進行赤星病病菌接種時，對赤星病的發(fā)病 程度影響差異很大，且出現(xiàn)了接菌不發(fā)病或發(fā)病不理想的問題，接種方法的不成熟會限制 了病原菌與寄主互作研宄工作的開展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了彌補以上領(lǐng)域的不足，本發(fā)明提供了煙草赤星病菌的人工接種方法。
[0006] 本發(fā)明所提供的煙草赤星病菌的人工接種方法，包括如下步驟：
[0007] (1)取煙草葉片，表面經(jīng)流水沖洗潔凈后，取接種點，用針頭刺破接種點部位的葉 片，制造傷口準備接種；
[0008] (2)用注射器吸取煙草赤星病菌的分生孢子液，從所述煙草葉片正面的接種點處 注入葉肉組織內(nèi)，得到接種后的煙草葉片；所述分生孢子液的濃度為1X105孢子/mL~ 1X107孢子/mL;所述煙草赤星病菌的菌齡為5天~15天；
[0009] (3)將所述接種后的煙草葉片的葉基處保濕，并置于28~30°C的條件下黑暗培養(yǎng) 8小時后，再進行12小時光照黑暗交替培養(yǎng)；培養(yǎng)7~15天。
[0010] 所述步驟（1)中所述煙草葉片為煙草植株下部的成熟葉片。
[0011] 所述煙草植株下部的成熟葉片為煙株下部倒數(shù)第3片葉。
[0012] 所述步驟⑵中所述分生孢子液的濃度為1X106孢子/mL。
[0013] 所述步驟（2)中所述煙草赤星病菌的菌齡為10天或15天。
[0014] 所述步驟⑵中所述接種的量為10yL。
[0015] 所述步驟（3)中所述煙草葉片的葉基處保濕為用浸泡無菌水的脫脂棉球保濕，并 用保鮮膜覆蓋保濕。
[0016] 本發(fā)明所提供的煙草赤星病菌（鏈格孢菌）致病性測定的室內(nèi)人工接種方法，結(jié) 果表明，利用赤星病菌孢子懸浮液經(jīng)離體葉片傷口注射對成熟葉片進行接種，病菌的分生 孢子可以直接進入葉片內(nèi)，借助水分及寄主葉肉組織營養(yǎng)萌發(fā)、擴繁，向細胞間擴展，局部 組織死亡形成的病斑會得到大面積擴大?？蛇_到接種率高，發(fā)病程度適中的效果，這為鑒定 我國煙草主產(chǎn)區(qū)不同赤星病菌致病性及小種差異及煙草赤星病抗性品種的篩選提供了一 種簡易、方便、快速、準確的人工接種方法，具有較好的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0017] 圖1為離體葉片傷口注射法接種后10d寄主發(fā)病情況；CK:無菌水對照；A，B:供試 赤星病菌孢子懸浮液接種。
[0018] 圖2為15d時接種葉片發(fā)病典型癥狀。
[0019] 圖3為不同接種濃度下的發(fā)病情況比較（接種后第8d)。
[0020] 圖4為不同葉齡的接種效果比較。
[0021] 圖5為不同接種方法發(fā)病情況比較；ck;a:傷口注射法；b:菌絲塊法；c:孢子液懸 滴法；d:孢子液棉球法；e:菌絲懸滴法。
【具體實施方式】
[0022] 實施例1、煙草赤星病的人工接種方法
[0023] 1.試驗材料
[0024] 1. 1接種赤星病分離物及來源
[0025] 供試赤星病分離物，采用文獻（孫麗萍.煙草突變體抗赤星病快速高通量篩選鑒 定方法研宄.2013,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文.）中的赤星病分離物作為本實驗的供 試菌株，由本實驗室保存；保存與活化菌株的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA)(方中 達?植病研宄法（第三版），2007.)。
[0026] 1.2供試品種
[0027] 烤煙品種K326(記載過該烤煙品種K326的非專利文獻是："王樹會，等.K326和云 煙85不同部位煙葉揮發(fā)性成分分析，煙草科技，2005, 4 :35-37"），由中國煙草總公司青州 煙草研宄所中國煙草核心種質(zhì)庫提供。
[0028] 1.3接種工具及測定儀器
[0029] 接種注射器為lmL醫(yī)用注射器，血球計數(shù)儀測定分生孢子懸浮液濃度。
[0030] 2.試驗方法及結(jié)果
[0031] 2. 1赤星病菌培養(yǎng)
[0032] 將低溫保存的供試赤星病菌株活化后打取菌餅（d= 0. 5cm)轉(zhuǎn)接