檢測jak2基因v617f位點多態(tài)性的引物、試劑盒及其pcr方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學基因檢測領域，特別提供了一種檢測JAK2基因多態(tài)性的 引物、試劑盒及其PCR方法，用于JAK2基因V617F多態(tài)性位點的快速檢測。
【背景技術】
[0002] JAK是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，迄今為止共發(fā)現有4個家族成員，分別為 JAK1、JAK2、JAK3和JAK4。STAT是JAK的直接底物，能將信號直接傳遞到核內，調節(jié)特定基 因的表達。JAK-STAT信號通路是與細胞生長、增殖、分化關系十分密切的一條信號通路，也 參與造血和免疫等系統(tǒng)的信號轉導，而激酶JAK對整個信號通路激活起著關鍵作用。迄今 已在人類白血病細胞中發(fā)現多種JAK基因點突變，其中一些突變能導致STAT蛋白持續(xù)激 活。例如JAK2基因V617F突變可導致JAK-STAT信號通路的異常激活，導致骨髓細胞產生 異常增殖。
[0003] 骨髓增殖性疾?。╩yeloproliferative diseases，MPD)是一組造血干細胞腫瘤增 生性疾病。在骨髓細胞普遍增生的基礎上有一系或多系細胞尤其突出，呈持續(xù)不斷的過度 增殖和外周血中成熟細胞數量增多為特征。其臨床表現具有異質性，但各亞型幾乎都伴有 白細胞、血小板及巨核細胞增多，后期出現骨髓纖維化和骨髓衰竭，隨病程進展部分可轉化 為其他疾病。其經典的分類主要分為慢性粒細胞白血?。╟hronic myelogenous leukemia， CML)、真性紅細胞增多癥（polycythemia vera，PV)、原發(fā)性血小板增多癥（essential Thrombocythemia，ET)以及原發(fā)性骨髓纖維化（primary myelofibrosis，PMF)等。
[0004] JAK2基因V617F多態(tài)性位點發(fā)生在65%~97%的真性紅細胞增多癥（PV)、23%~57% 的原發(fā)性血小板增多癥（ET)及35%~57%的原發(fā)性骨髓纖維化（PMF)患者中。根據JAK2突 變與骨髓增生性疾病的密切關系，在修訂的2008世界衛(wèi)生組織（WHO)分類系統(tǒng)中，JAK2基 因V617F多態(tài)性位點成為慢性骨髓增殖性疾?。∕PD)主要的診斷指標。
[0005] 目前對基因突變和基因多態(tài)性的檢測，常見有直接測序法；基因芯片雜交法； PCR-RFLP方法；PCR擴增產物毛細管電泳分析法；PCR-SSCP;PCR高分辨熔解曲線分析技 術；PCR-TaqmanMGB(MinorGrooveBinder)探針法；AS-PCR法；Cast-PCR法等。這些方 法或多或少還存在儀器價格高，操作難度大，存在一定假陰性和假陽性，檢測成本高，臨床 普及程度低，不能同時大規(guī)模檢測臨床標本等缺點。
[0006] 如：1)直接測序法是突變分析的金標準，能發(fā)現已知和未知突變位點，但該法檢測 基因突變的靈敏度為20%(即目的基因的突變基因DNA模板數占野生型DNA模板數的20%)。 同時還存在操作復雜，周期長，分析速度慢，常需要2天的時間，而且該法是開管操作，大大 增加污染的可能性，不適合對大規(guī)模標本的檢測，同時還需要昂貴的儀器，存在在基層不易 實施等缺點。
[0007] 2)普通PCR-RFLP方法技術簡便，價格便宜，適宜少量樣本的實驗室檢測，但RFLP 僅能檢測有酶切位點的突變，無酶切位點不能檢測，費時費力，還存在PCR產物污染導致 假陽性的風險，見[MolDiagnTher. 2010Jun1; 14(3): 163-9，UnitedStatesPatent20120135406]。
[0008] 3)芯片技術與傳統(tǒng)的儀器檢測方法相比具有高通量、微型化、自動化等特點，適用 于全基因組突變掃描，不適宜單個基因的突變位點檢測，且精度低，價格昂貴。
[0009] 4)PCR高分辨熔解曲線分析技術，能高通量檢測基因的突變情況，試劑成本較低， 但因其熒光信號來自染料，特異性受到影響，而且檢測儀器是升級版的熒光PCR儀，價格高 昂，普及受限，見[ClinChimACta. 2012Nov12;413(21-22):1781-5;UnitedStates Patent20110045479]〇
[0010] 5)PCR-TaqmanMGB探針法適合已知突變位點，常常需要兩條探針，而Taqman MGB探針的合成價格是普通Taqman探針的幾倍，見[JClinMicrobiol. 2010 Aug;48(8):2909-15;UnitedStatesPatent20090311679]，并且不能檢測樣本中的含量 較少（彡1，〇〇〇個中的1個）的等位基因或突變位點。
[0011] 6)PCR-SSCP法雖然簡單，但該法是開放性的檢測系統(tǒng)，容易造成PCR產物的污染， 而且操作步驟多，費時費力。
[0012] 7)等位基因特異性引物PCR擴增法（AS-PCR)，這一方法是目前檢測基因突變或 多態(tài)性最簡單快速的方法（WuDY,UgozzoliL,PalBK,WallaceRB.，ProcNatl AcadSciUSA1989; 86:2757-2760)，其原理是引物3'末端堿基與模板的堿基錯配，其PCR 的效率將會下降 1〇3-1〇6.6倍（Chen,X.，andSullivan,PF,ThePharmacogeonomics Journal2003，3，77-96)。盡管該方法的原理簡單，但錯配的引物，依然會發(fā)生非特異 性擴增，擴增情況視突變的類型和檢測位點周圍的堿基序列相關（AyyadevaraS,Thaden JJ,ShmooklerReisRJ.,AnalBiochem2000; 284:11-18)，還與樣本中存在的等位 基因變量的影響。為了增加AS-PCR的特異性，許多科學家做了很多努力。大量的實驗證 明，該方法最關鍵的是設計與3'末端突變位點堿基互補或錯配的兩條特異引物，引物設 計不好，將導致高背景的交叉擴增，會導致較高的假陽性。盡管不少人努力將這一弊端克 月艮，如報道的TaqMAMA方法，在3'倒數第二位或第三位上引入突變堿基，的確可以增加反 應的特異性，但仍然無法完全消除假陽性，而且在純合子與雜合子的判斷上，缺乏標準， 會出現混亂的情況，見[JVirolMethods. 2008Nov;153(2):156-62;Genomics. 2004 Feb;83 (2) :311-20]。簡單的AS-PCR，通常采用PCR反應結束后再進行電泳，從有無反應 條帶來判斷結果，這種方法雖然不需要昂貴的儀器，但電泳操作，增加了PCR的污染機會， 而且耗時費力。盡管有人對該方法作了改進，采用熒光定量PCR技術，但得到的不是"全或 無"式的結果，總會有非特異性反應的發(fā)生，即同樣的引物對野生型和突變型位點都會擴 增，只是其得到的Ct(Cyclethreshold)不同而已，因此就引入了ACt的概念，即ACt= 野生Ct-突變Ct，但計算復雜，如要ACt值大于純合子Ct值判為突變型純合子，ACt值 小于雜合子Ct值，判為雜合子，ACt值的引入不僅增加了操作步驟，還會引起混亂，因為 ACt值的設定標準無法準確定位，不同人員的操作、不同的標本和不同的檢測儀器都會有 不同的數字，給臨床應用帶來很大的困難，實際應用依然受限，見[中國專利CN101235415， CN101565742A]〇
[0013] 8)美國LIFE公司采用一種MGB封閉探針的方法，稱作Cast-PCR(Competitive allelespecificTaqmanPCR)，用MGB探針將不檢測的位點封閉，然后用等位基因特異 引物熒光定量PCR的方法檢測目的位點，這雖然提高了檢測的特異性，但由于多加入一 條MGB封閉探針，勢必增加成本，對反應效率多少會帶來干擾，見[ExpMolPathol. 2012 Jun; 92 (3): 275-80;UnitedStatesPatent20100221717 ;CN102428190A]。有人采用鎖 核酸（LNA) (PlantMethod2007, 3 :2)或修飾的堿基（AnalBiochem. 2005, 340 :287-294) 的PCR引物，可以使得AS-PCR檢測靈敏度提高。然而，這些方法增加了分析的總體成本，并 需對反應進行深度優(yōu)化。
[0014] 因此，如何對JAK2基因V617F多態(tài)性位點進行簡單準確的檢測，成為人們亟待解 決的問題。

【發(fā)明內容】

[0015] 鑒于此，本發(fā)明提供了一種檢測JAK2基因V617F多態(tài)性位點的引物、試劑盒及其 PCR方法，以至少解決以往試劑盒存在的結果判讀復雜、檢測儀器價格高，操作難度大，存在 一定假陰性和假陽性，檢測成本高，臨床普及程度低，不能同時大規(guī)模檢測臨床標本等一個 或多個問題。
[0016] 本發(fā)明提供的方案具體為：一種檢測JAK2基因V617F多態(tài)性位點的引物，其特征 在于