交至其片段。
[0081] 或者，能夠利用已知算法（例如BLAST、FASTA)針對變異體序列在電腦中掃描序 列數(shù)據(jù)庫。這樣有助于將變異體序列與其他植物物種或其他多重番茄分離。如下文所述， 本文中尤其包括在番茄的其他變體或其他植物物種中發(fā)現(xiàn)的相同基因（ShzFPS、ShZIS和 ShTPS9)的等位基因的啟動子，尤其是馬鈴薯（Solanum)屬的種。例如，cDNA文庫可由一 種或多種植物物種、一種或多種變體、或一種物種或變體的不同組織來構(gòu)建?？舍槍屋?烯合成酶1或倍半萜烯合成酶IcDNAs(利用例如，衍生自SEQ ID N0:4、3、l、2或其片段或 變體的探針或引物）掃描cDNA文庫。同樣，可以使用不同的顯示方法（例如cDNA-AFLP) 來鑒定這樣的轉(zhuǎn)錄本。例如TAIL-PCR(Liu等人1995，Genomics 25(3):674-81 ;Liu等人 2005，Methods Mol Biol. 286:341-8)、Linker-PCR 或 Inverse PCR(IPCR)的方法可用于分 離基因的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。
[0082] 相同基因的變體，即分別編碼法呢基二磷酸合成酶（ShzFPS)、姜烯合成酶 (ShZIS)、和大根香葉烯合成酶（ShTPS9)的基因的直系同源和/或同源基因包括，例如， 包含與GenBank登錄號FJ194969 (多毛番茄zFPS cDNA和蛋白；Sal laud等人，2009 _ Plant Cells)、JN990661 (多毛番前 ZIS ;Gonzalezs_Vigil 等人，2012 - Plant Journal cDNA and Protein)、和 JN402388(多毛番茄 TPS9cDNA;Bleeker 等人 2011-Plant Mol. Biol. 77(4-5) :323-336)的核苷酸序列或氨基酸序列具有至少50、55、60、65、70、75、80、 85、90、95、96、97、98、99%或更多個核酸或氨基酸序列同一性的核酸序列（0嫩或1?隱)）或 氨基酸序列。優(yōu)選地，通過利用Needleman和Wunsch或者Smith Waterman Pairwise比 對（例如，Embosswin中的程序"needle"或"water"，例如，2· 10. 0版本具有默認(rèn)空位產(chǎn)生 罰分和空位延伸罰分）來確定序列同一性。這些變體的啟動子優(yōu)選在其活性方面是毛狀體 特異性的?？梢允褂美鏲DNA-AFLP、其他基于PCR的方法或Northern雜交的方法來分離 或鑒定這樣多基因。能夠利用已知的方法來克隆它們的啟動子。在優(yōu)選的實施方式中，該 啟動子獲自來自屬于茄科的植物的ShzFPS、ShZIS或ShTPS9基因，例如馬鈴薯（Solanum) 屬的種（包括重新分類為番前的種）、煙草屬（Nicotiana)、辣椒屬（Capsicum)、碧冬前屬 (Petunia)、咖啡屬（Coffea)等等。來自野生種的直系同源基因尤其合乎需要。
[0083] 能夠利用各種方法來確定核酸序列（或變異體的片段）是否具有組成性啟動子活 性，即，其是否能夠賦予毛狀體轉(zhuǎn)錄特異性，該活性是否"強"，以及該核酸序列的活性是否 對于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、組織、器官或有機體（尤其是植物或植物細(xì)胞）可能暴露的至少一種（但 優(yōu)選更多的，最優(yōu)選任意）生物和/或非生物脅迫不敏感。通常，人們能夠區(qū)分定性方法和 定量方法。定性方法（例如組織學(xué)GUS染色）被用于確定啟動子的時間-空間活性（其是 啟動子活性的或在某些組織或器官中或在某些/發(fā)育條件下無活性），而定量方法（例如熒 光測定GUS分析）也能夠定量分析相比于對照的活性的水平。適合的對照為，例如，用空白 載體轉(zhuǎn)化的植物（陰性對照）或用包含其他啟動子的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物，例如擬南芥CER6 啟動子（Hooker等人，2002, Plant Phys 129, 1568)其在煙草（N. tabacum)的表皮和毛狀體 中有活性，非轉(zhuǎn)基因擬南芥植物。
[0084] 為了測試和可選地定量分析相對或絕對活性，克隆的或合成的核酸分子，例如SEQ ID N0:4、3、l或2或其變體或它們之中任一種的片段可被操作性連接至已知核酸序列（例 如，報告基因，例如gusA，或編碼特異性蛋白的任何基因）并且其可被用于利用已知方法轉(zhuǎn) 化植物細(xì)胞并由其再生植物。
[0085] 啟動子的活性能夠例如通過檢測下游核酸序列的RNA轉(zhuǎn)錄本的水平來進(jìn)行分析 (并且可選地定量分析），尤其是在毛狀體細(xì)胞中。這可以利用定量方法來完成，例如，定量 RT-PCR或其他基于PCR的方法等等?；蛘?，可以分析和定量分析該報告子蛋白或該報告子 蛋白的活性。例如，如果該報告子蛋白基因為gus基因，則可以使用熒光GUS分析，如在實施 例中所述的。這樣，能夠?qū)⒈３衷谡Ｉ恚ǚ?脅迫）條件下的轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞 的定量啟動子活性水平與暴露于一種或多種生物或非生物脅迫的植物或植物細(xì)胞的水平 相比較。而且，毛狀體細(xì)胞中的相對或絕對活性水平能夠與組成性對照啟動子，例如35S啟 動子、雙-35S啟動子，或與在毛狀體中具有活性的其他啟動子，例如MKSl啟動子、CYP71D16 啟動子或OASAl啟動子進(jìn)行對比。應(yīng)理解，優(yōu)選利用統(tǒng)計學(xué)方法來確定和比較平均啟動子 活性水平。
[0086] 因此，不論在特定時間在毛狀體細(xì)胞中是否發(fā)現(xiàn)活性（時間-空間活性），都能夠 例如，通過用轉(zhuǎn)化用啟動子-報告子基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物或植物細(xì)胞并在RNA轉(zhuǎn)錄本或報 告蛋白（或其活性）的不同發(fā)育階段對毛狀體進(jìn)行分析來進(jìn)行測試。一個樣品測試采用例 如組織化學(xué)⑶S染色，從而可視化評價藍(lán)色指示毛狀體中以及在毛狀體的不同發(fā)育階段的 活性。
[0087] 如已經(jīng)提到過的，優(yōu)選啟動子活性是組成性的并且還優(yōu)選在毛狀體細(xì)胞中活性 強，尤其是在宿主物種中或根據(jù)所引入序列而不同。組成性活性意指優(yōu)選在最（正常， 非-脅迫的）生理學(xué)和發(fā)育條件下在毛狀體細(xì)胞中操作性地連接于啟動子的任意核酸序列 的轉(zhuǎn)錄本。在一種實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的啟動子優(yōu)選在表皮細(xì)胞中無活性。優(yōu)選地，啟 動子在在莖、花和/或（新）葉中發(fā)現(xiàn)的所有腺毛中均有活性。
[0088] 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的啟動子在雙子葉種和單子葉種的所有植物種的毛狀體中提 供強的、組成性活性，例如下文中所述的（例如，番茄、煙草、蕓苔、瓜類和萵苣等）。
[0089] 根據(jù)其驅(qū)動連接至下游（3'）的核酸序列的表達(dá)的能力，能夠利用各種已知方法 定量確定根據(jù)本發(fā)明的啟動子（包括片段或變體）的強度（定量活性）。例如，能夠利用 RNA印跡分析或定量RT-PCR或下一代測序來定量分析所轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄本（mRNA)的量。優(yōu)選 地，在正常（非-脅迫）條件下，啟動子強度至少基本等于在CaMV 35S的毛狀體中的活性 (Franck等人，同上）。因此，"強"意指在正常、非脅迫條件下，啟動子強度優(yōu)選至少等于，但 更優(yōu)選強于毛狀體中35S啟動子的強度。最優(yōu)選地，毛狀體中的平均定量啟動子活性至少 等于CaMV 35S啟動子的活性，或者為高于毛狀體中CaMV 35S啟動子的平均活性至少5%， 10%，20%，30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%，70%，75%，或更高。應(yīng)該理解，應(yīng)該比 較相同拷貝數(shù)和接合性（zygosity)水平的轉(zhuǎn)化體，例如，轉(zhuǎn)基因的半合子或純合子。優(yōu)選 地，鑒定并比較單拷貝轉(zhuǎn)化體。能夠通過分析并且優(yōu)選定量分析例如，P35S-GUS植物中的 GUS基因表達(dá)并將其與根據(jù)本發(fā)明的啟動子的表達(dá)相比較來測試宿主植物的毛狀體中的 35S啟動子的強度。
[0090] 優(yōu)選地，啟動子強度為至少基本上等于在生理（非-脅迫的）條件下甲基酮合成 酶I (SlMKSl)啟動子在毛狀體中的活性（Fridman等人，同上）。因此，"強"意指優(yōu)選至 少大約等于但更優(yōu)選比生理非-脅迫的條件下毛狀體中SlMKSl啟動子的活性更強的啟動 子強度。最優(yōu)選地，毛狀體中的平均定量啟動子活性至少等于毛狀體中SlMKSl啟動子的活 性，或比SlMKSl啟動子的平均活性高至少兩倍、4倍、6倍、8倍、10倍或更多。應(yīng)該理解，應(yīng) 該比較相同拷貝數(shù)和接合性水平的轉(zhuǎn)化體，例如，轉(zhuǎn)基因的半合子或純合子。優(yōu)選地，鑒定 和比較單拷貝轉(zhuǎn)化體。宿主植物的毛狀體中的SlMKSl啟動子的強度能夠通過分析并優(yōu)選 定量分析例如，P S1MKS1-GUS植物中的GUS基因表達(dá)并將其與根據(jù)本發(fā)明的啟動子的表達(dá) 相比較來測試。
[0091] 因此，當(dāng)包含該啟動子的植物組織或器官或植物暴露于脅迫條件時，根據(jù)本發(fā)明 的啟動子的強度優(yōu)選保持基本不變，或者至少不下降（或基本不下降），所述脅迫條件選自 以下至少一種或優(yōu)選多種：干旱脅迫、熱脅迫、水-脅迫（水過多或水過少）病原體脅迫（例 如，病毒感染例如CMV、真菌感染、細(xì)菌感染等）、害蟲脅迫（例如，植食性昆蟲）受傷、鹽脅 迫輻照脅迫等等。而且，定量測試能夠被用于確定它。例如，可將包含該啟動子的重組植物 從溫度環(huán)境轉(zhuǎn)移至溫暖環(huán)境（例如約27°C至高達(dá)約50°C )，并且可以在比較在正常溫度條 件下和溫暖溫度條件下不同組織中的啟動子活性和相同組織中的活性。
[0092] 在一種實施方式中，提供了任意上述啟動子用于在重組細(xì)胞或有機體尤其是植物 細(xì)胞或植物中表達(dá)同源或異源核酸序列的應(yīng)用。如下文中進(jìn)一步描述的，這種應(yīng)用包含就 愛你個啟動子操作性連接至同源或異源核酸序列以及轉(zhuǎn)化植物或植物細(xì)胞。
[0093] 盡管上文中關(guān)注的焦點在于根據(jù)本發(fā)明的啟動子在植物和植物細(xì)胞中的應(yīng)用，但 本發(fā)明的實施方式還關(guān)注了該啟動子用于在其他細(xì)胞和有機體中表達(dá)同源或異源核酸序 列的應(yīng)用，例如在任意原核或真核細(xì)胞或有機體中，例如，細(xì)菌、真菌（包括酵母，例如畢赤 酵母、漢遜酵母等）、哺乳動物、人細(xì)胞或細(xì)胞系等等。
[0094] 枏據(jù)本發(fā)明的嵌合基閔和裁體
[0095] 在本發(fā)明的一種實施方式中，具有啟動子活性的核酸序列中的任一種被用于制備 嵌合基因，并且包含這些嵌合基因的載體用于將嵌合基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中并且在宿主細(xì) 胞中表達(dá)操作性連接的同源或異源核酸序列，宿主細(xì)胞例如是來源于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的細(xì)胞、 組織、器官或整個有機體。
[0096] 宿主細(xì)胞優(yōu)選為植物細(xì)胞。任何植物可以為適合的宿主，例如單子葉植物或 雙子葉植物，例如玉米/黍類（玉蜀黍?qū)伲?，玉米（Z. mays)、二倍體多年生類玉米種 (Z. diploperennis) (chapule)、繁茂類玉米種（Zea luxurians) (Guatemalan teosinte)、 委委特南戈類玉米亞種（Zea mays subsp.Huehuetenangensis) (San Antonio Huista teosinte)，墨西哥類玉米亞種（Mexican teosinte)、小穎類玉米亞種（Z. mays subsp. Parviglumis) (Balsas teosinte)、四倍體多年生類玉米種（Z. perennis) (perennial teosinte)和 Z. ramosa，小麥（Triticum species)，大麥（例如，Hordeum vulgare)，燕 麥（例如，Avena sativa)，高梁（surghum bicolor)，黑麥（Secale cereale)，大豆（大 豆屬（Glycine spp)，例如，黃豆（G. max))，棉花（樹棉種（Gossypium species)，例如，陸 地棉（G.hirsutum)、海島棉（G.barbadense))，蕓苔屬（例如，歐洲油菜（B.napus)、芥菜 (B. juncea)、野甘藍(lán)（B. oleracea)、憲菁（B. rapa)等等），向日葵（Helianthus annus)， 煙草（煙草種），苜蓿（Medicago sativa)，水稻（水稻種，例如，超級雜交水稻兩優(yōu)培九 (0. sativa indica cultivar-group)或 japonica cultivar-group)，牧草，珍珠稷（狼 尾草種，例如，珍珠栗（P. glaucum))，樹種，蔬菜種，如番前屬（Lycopersicon ssp)(最近 被重新分類為屬于茄屬），例如，番茄（別稱為Lesculentum)例如，櫻桃番茄，櫻桃番 前變種（var.cerasiforme)或目前的番前，醋栗番前變種（var.pimpinellifolium))或 樹番前（S.betaceum，別稱為 Cyphomandra betaceae)，馬鈴薯（Solanum tuberosum)和 其他前種，例如前子（前子（Solanum melongena))，香瓜前（香瓜前（S.muricatum))， 可可（S. sessiliflorum)和奎東前(S. quitoense);古月椒（Capsicum annuum, Capsicum frutescens)，碗豆（例如，Pisum sativum)，豆（例如，豆種（Phaseolus species))，胡蘿卜 (野胡蘿卜（Daucus carota))，萬苣種（例如 Lactuca sativa、山萬苣（Lactuca indica)、 Lactuca perennis)，黃瓜（Cucumis sativus)、甜瓜（Cucumis melo)，西萌蘆（Cucurbita pepo)，輿瓜（輿瓜（Cucurbita maxima)、西萌蘆（Cucurbita pepo)、灰軒南瓜（Cucurbita mixta))，南瓜（Cucurbita pepo)，西瓜（Citrullus Ianatus 別稱為Citrullus vulgaris)， 肉質(zhì)果種（葡萄、桃、李、草莓、芒果、甜瓜），觀賞種（例如，玫瑰、矮牽牛、菊屬、百合、郁金 香、大丁草種），木材樹種（例如，楊屬、柳屬、櫟屬、桉屬的種），纖維種例如，亞麻（Linum usitatissimum)和大麻（Cannabis sativa)。在一種實施方式中，優(yōu)選蔬菜種，尤其優(yōu)選前 種（包括番茄種）。
[0097] 因此、可轉(zhuǎn)化例如以下屬中的種：南瓜（Cucurbita)、羅薩（Rosa)、葡萄 (Vitis)、草莓（Juglans)、核桃（Fragaria)、蓮子（Lotus)、紅豆草（Medicago)、紫花苜蓿 (Onobrychis)、三葉草（Trifolium)、萌蘆（Trigonella)、5工豆（Vigna)、柑橘（Citrus)、亞 麻（Linum)、天竺葵（Geranium)、蜀葵（Manihot)、胡蘿卜（Daucus)、蘿卜（Arabidopsis)、甘 藍(lán)（Brassica)、擬南芥（Raphanus)、芥末（Sinapis)、辣椒（Atropa)、曼陀羅（Capsicum)、 顛前（Datura)、莨菪（Cucumis)、黃瓜（Hyoscyamus)、番前（Lycopersicon)、馬鈴薯 (Solanum)、煙草（Nicotiana)、海棠（Malus)、矮牽牛（Petunia)、洋地黃（Digitalis)、 Majorana、Ciahorium、向日葵（Helianthus)、萬苣（Lactuca)、無芒雀麥（Bromus)、西瓜 (Citrullus)、蘆輿（Asparagus)、金魚草（Antirrhinum)、Heterocallis、Nemesis、天竺葵 (Pelargonium)、Panieum、狼尾草（Pennisetum)、毛首（Ranunculus)、千里光（Senecio)、蛾 蝶花（Salpiglossis)、Browaalia、棉花（Glycine)、碗豆（Pisum)、綠豆（Phaseolus)、大豆 (Gossypium)、棉花（Glycine)、黑麥草（Lolium)、高羊茅（Festuca)、剪股穎（Agrostis)。進(jìn) 一步優(yōu)選南瓜、甘藍(lán)、番茄、馬鈴薯、水稻和玉米。優(yōu)選燕麥、苜蓿、辣椒、煙草、萵苣、豌豆、黃 瓜、南瓜、甘藍(lán)、茄子（包括番茄）、水稻和玉米。
[0098] 嵌合基因的構(gòu)建體和用于將嵌合基因引入到宿主細(xì)胞基因組中的載體通常是本 領(lǐng)域公知的。為了產(chǎn)生嵌合基因，利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將毛狀體特異性啟動子序列 操作性連接至在宿主細(xì)胞中待轉(zhuǎn)錄的另一核酸序列。該啟動子序列可以已經(jīng)在載體中存 在，以使得該待轉(zhuǎn)錄的核酸序列被簡單地插入到啟動子序列的載體下游中。然后，該載體 被用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并且優(yōu)選將嵌合基因插入到核基因組中或插入到質(zhì)體、線粒體或 葉綠體基因組中，以使得該下游核酸序列由于啟動子活性而被表達(dá)（例如，Mc Bride等 人，1995Bio/Technology 13, 362 ;US 5, 693, 507) 〇
[0099] 因此，嵌合基因優(yōu)選包含如上文所述的毛狀體特異性啟動子，其操作性連接于同 源或異源核酸序列，并且接著操作性連接于3'未翻譯核酸序列（3'UTR)。該同源或異源核 酸序列可以是編碼蛋白或肽的序列，或者可以是轉(zhuǎn)錄到活性RNA分子中的序列，例如在宿 主細(xì)胞或有機體中適合用于沉默基因或基因家族的正義和/或反義RNA(正義和反義RNA 包括例如dsRNA或莖-環(huán)RNA結(jié)構(gòu)）。
[0100] 包含毛狀體特異性啟動子的嵌合基因能夠以常規(guī)方式被穩(wěn)定地插入到單個植物 細(xì)胞的核基因組中，并且該如此轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞能夠以常規(guī)方式被用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)化的植物， 該轉(zhuǎn)化的植物由于嵌合基因的表達(dá)而具有改變的表型。