木聚糖分解酶測定的最近進展總結于若干出版物中，這些出版物包 括：另U雷（Biely)和普喬爾德（Puchard)，木聚糖分解酶測定的最近進展（Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes)，2006,食品與農(nóng)業(yè)科學雜志（Journal of the Science of Food and Agriculture)86(ll) :1636-1647;斯帕尼科瓦（Spanikova)和別雷， 2006,葡萄糖醛酸醋酶-由產(chǎn)生的新型碳水化合物醋酶裂裙菌（Schizophyllum commune) (Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune)，歐洲生化學會聯(lián)合會快報（FEBS Letters) 580 (19) : 4597-4601 ;赫爾曼 (Herrmann)、沃散斯卡（Vrsanska)、尤日奇科娃（Jurickova)、赫西（Hirsch)、另 Ij雷、以及 庫比切克（Kubicek)，1997,里氏木霉的β-D-木糖苷酶是一種多功能β-D-木聚糖木 糖水角軍酶(The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylan xylohydrolase)，生物化學雜志（Biochemical Journal) 321:375-381。
[0037] 總木聚糖降解活性可以通過測定由不同類型的木聚糖（包括例如燕麥（oat spelt)木聚糖、山毛櫸木木聚糖、以及落葉松木木聚糖）形成的還原糖，或通過光度法測定 從不同共價染色的木聚糖釋放的染色的木聚糖片段來測量。最常見的總木聚糖分解活性測 定基于由聚合4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖產(chǎn)生的還原糖，如描述于別雷（Bailey)，別雷，坡 泰恩（Poutanen)，1992,用于木聚糖酶活性測定的多個實驗室測試方法（Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity)，生物技術雜志（Journal of Biotechnology) 23 (3) :257-270 中。木聚糖酶活性還可以在 37°C下，在 0.01% TRITON? X-100 (4-(1，1，3, 3-四甲基丁基）苯基-聚乙二醇）和200mM磷酸鈉緩沖液（pH 6)中用 0. 2% AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作為底物來測定。一個單位的木聚糖酶定義為在200mM磷 酸鈉緩沖液（pH 6)中，在37°C、pH 6下，從作為底物的0.2% AZCL-阿拉伯糖基木聚糖中 每分鐘生成1. 0微摩爾天青精。
[0038] 出于本發(fā)明的目的，木聚糖降解活性通過測量由木聚糖降解酶在以下典型條件下 造成的樺木木聚糖（西格瑪化學有限公司（Sigma Chemical Co.，Inc.)，圣路易斯，密蘇里 州，美國）水解的增加來測定：1ml反應、5mg/ml底物（總固體），5mg木聚糖分解蛋白質(zhì)/g 底物、50禮乙酸鈉（?!15)、50°0、24小時，如里弗（1^%1〇，1972，用于碳水化合物的比色測 定的新反應（A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates)，分 析生物化學（Anal. Bi〇Chem)47:273-279所述使用對羥基苯甲酸酰肼（PHBAH)測定進行糖 分析。
[0039] 木聚糖酶：術語"木聚糖酶"意指1，4- β -D-木聚糖-木糖水解酶（E. C. 3. 2. 1. 8)， 其催化木聚糖中的l，4-f3_D-木糖苷鍵的內(nèi)切水解。出于本發(fā)明的目的，在37°C下，在 0. 01% TRITON? X-100和200mM磷酸鈉 （pH 6)中用0. 2% AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作 為底物來測定木聚糖酶活性。一個單位的木聚糖酶定義為在200mM磷酸鈉緩沖液（pH 6) 中，在37°C、pH 6下，從作為底物的0. 2% AZCL-阿拉伯糖基木聚糖中每分鐘生成1. 0微摩 爾天青精。
[0040] 其他宙義
[0041] 作物籽粒：術語"作物籽粒"包括來自例如玉米（玉蜀黍）、水稻、大麥、高粱大豆、 果殼、以及小麥的籽粒。玉米籽粒是示例性的。已知多種玉米籽粒，包括例如馬齒型玉米、 硬粒玉米、有稃種玉米、具條紋玉米、甜玉米、糯玉米等。
[0042] 在一個實施例中，該玉米籽粒是黃色馬齒型玉米籽粒。黃色馬齒型玉米籽粒具有 稱為"果皮（Pericarp)"的外部覆蓋物，保護籽粒中的胚芽。它防水和水蒸氣并且是昆蟲和 微生物所不希望的。
[0043] 未被"果皮"覆蓋的籽粒的唯一區(qū)域是"頂帽（Tip Cap)"，它是籽粒至穗軸的附著 點。
[0044] 胚芽："胚芽"是玉米籽粒的唯一存活部分。它包含籽粒生長為玉米植株所必需的 遺傳信息、酶、維生素以及礦物質(zhì)。在黃色馬齒型玉米中，約25%的胚芽是玉米油。覆蓋且 包圍胚芽的胚乳構成約82%的籽粒干重并且是種子萌發(fā)的能量（淀粉）和蛋白來源。存在 兩種類型的胚乳，軟胚乳和硬胚乳。在硬胚乳中，淀粉被緊緊地堆積在一起。在軟胚乳中， 淀粉是松散的。
[0045] 淀粉：術語"淀粉"意指由植物的復雜多糖構成、由廣泛出現(xiàn)在植物組織中的呈貯 藏粒形式的葡萄糖單元構成、由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成且表示為（C6H1005)η(其中η是 任何數(shù)字）的任何材料。
[0046] 研磨的：術語"研磨的"是指植物材料已經(jīng)例如通過粉碎、分級、碾磨、磨碎等而被 分解成更小的顆粒。
[0047] 碾磨（grind或grinding):術語"碾磨"意指破壞果皮并打開作物籽粒的任何方 法。
[0048] 浸漬（ste印或ste印ing):術語"浸漬"意指用水以及任選地S02浸泡作物籽粒。
[0049] 干固體：術語"干固體"是在干重基礎上的漿液的全固體（以百分比計）。寡糖： 術語"寡糖"是具有2至10個單糖單位的化合物。
[0050] 濕磨益處：術語"濕磨益處"意指改進的淀粉產(chǎn)量和/或純度，改進的面筋品質(zhì)和 /或產(chǎn)量，改進的纖維、面筋或浸漬水過濾、脫水和蒸發(fā)，更容易地分離胚芽和/或更好的糖 化后過濾及其過程能源節(jié)約中的一種或多種。
[0051] 等位基因變體：術語"等位基因變體"意指占據(jù)同一染色體基因座的基因的兩種或 更多種（例如，若干種）可替代形式中的任一種。等位基因變異由突變天然產(chǎn)生，并且可以 導致群體內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊模ㄔ谒幋a的多肽中沒有改變）或可編碼具 有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。
[0052] cDNA :術語"cDNA"意指可以通過從得自真核或原核細胞的成熟的、剪接的mRNA分 子進行反轉錄而制備的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于對應基因組DNA中的內(nèi)含子序列。 早先的初始RNA轉錄本是mRNA的前體，其在呈現(xiàn)為成熟的剪接的mRNA之前要經(jīng)一系列的 步驟進行加工，包括剪接。
[0053] 編碼序列：術語"編碼序列"意指直接指定一個多肽的氨基酸序列的多核苷酸。編 碼序列的邊界一般由一個開放閱讀框架決定，該開放閱讀框架從一個起始密碼子（如ATG、 GTG或TTG)開始并且以一個終止密碼子（如TAA、TAG或TGA)結束。編碼序列可以是一種 基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。
[0054] 片段：術語"片段"意指從成熟多肽主要部分的氨基和/或羧基末端缺失一個或多 個（例如，若干個）氨基酸的多肽；其中該片段具有酶活性。在一個方面中，片段包含酶的 成熟多肽的至少85%，例如至少90 %或至少95 %的氨基酸殘基。
[0055] 高嚴謹度條件：術語"高嚴謹度條件"意指對于長度為至少100個核苷酸的探針 而言，遵循標準DNA印跡程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/ml剪切并變性的 鮭魚精子DNA和50%甲酰胺中預雜交和雜交12至24小時。載體材料最終使用0.2X SSC、 0. 2 % SDS，在65 °C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0056] 低嚴謹度條件：術語"低嚴謹度條件"意指對于長度為至少100個核苷酸的探針 而言，遵循標準DNA印跡程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/ml剪切并變性的 鮭魚精子DNA和25%甲酰胺中預雜交和雜交12至24小時。載體材料最終使用0.2X SSC、 0. 2 % SDS，在50 °C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0057] 成熟多肽：術語"成熟多肽"意指在翻譯和任何翻譯后修飾如N末端加工、C末端 截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后處于其最終形式的多肽。
[0058] 在本領域中已知的是，宿主細胞可以產(chǎn)生由相同多核苷酸表達的兩種或更多種不 同的成熟多肽（即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸）的混合物。
[0059] 成熟多肽編碼序列：術語"成熟多肽編碼序列"意指編碼具有酶活性的成熟多肽的 多核苷酸。
[0060] 中嚴謹度條件：術語"中嚴謹度條件"意指對于長度為至少100個核苷酸的探針 而言，遵循標準DNA印跡程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/ml剪切并變性的 鮭魚精子DNA和35%甲酰胺中預雜交和雜交12至24小時。載體材料最終使用0.2X SSC、 0. 2 % SDS，在55 °C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0061] 中-高嚴謹度條件：術語"中-高嚴謹度條件"意指對于長度為至少100個核苷酸 的探針而言，遵循標準DNA印跡程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3 % SDS、200微克/ml剪切并 變性的鮭魚精子DNA和35%甲酰胺中預雜交和雜交12至24小時。載體材料最終使用0. 2X SSC、0. 2% SDS，在60°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0062] 親本酶：術語"親本"意指對其作出改變以產(chǎn)生變體的酶。親本可以是天然存在的 (野生型）多肽或其變體。
[0063] 序列一致性：兩個氨基酸序列之間或者兩個核苷酸序列之間的關聯(lián)度通過參數(shù) "序列一致性"來描述。
[0064] 出于本發(fā)明的目的，使用尼德曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（尼德曼 (Needleman)和翁施（Wunsch)，1970,分子生物學雜志（J. Mol. Biol. )48:443-453)來確 定兩個氨基酸序列之間的序列一致性，該算法如EMBOSS軟件包（EMBOSS :歐洲分子生物學 開放軟件套件（The European Molecular Biology Open Software Suite)，賴斯（Rice) 等人，2000,遺傳學趨勢（Trends Genet. ) 16:276-277)(優(yōu)選5. 0.0版或更新版本）的尼 德爾（Needle)程序所實施的。使用的參數(shù)是空位開放罰分10、空位擴展罰分0.5以及 EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩陣。尼德爾標注的"最長的一致性"的輸出 (使用-非簡化選項獲得）被用作百分比一致性，并且如下計算：
[0065] (一致的殘基X 100)八比對長度-比對中的空位總數(shù)）
[0066] 出于本發(fā)明的目的，使用尼德曼-翁施算法（尼德曼（Needleman)和翁施 (Wunsch)，1970,見上文）來確定兩個脫氧核苷酸序列之間的序列一致性，該算法如EMBOSS 軟件包（EMBOSS :歐洲分子生物學開放軟件套件，賴斯（Rice)等人，2000,見上文）（優(yōu)選 5. 0.0版或更新版本）的尼德爾程序所實施的。使用的參數(shù)是空位開放罰分10、空位擴展 罰分0. 5以及EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩陣。尼德爾標注的"最長的 一致性"的輸出（使用-非簡化選項獲得）被用作百分比一致性，并且如下計算：
[0067](一致的脫氧核糖核苷酸X 100V(比對長度-比對中的空位總數(shù)）
[0068] 子序列：術語"子序列"意指使一個或多個（例如，若干個）核苷酸從成熟多肽編 碼序列的5'端和/或3'端缺少的多核苷酸，其中該子序列編碼具有酶活性的片段。在一 個方面中，子序列包含酶的成熟多肽編碼序列的至少85%，例如至少90%或至少95%的核 苷酸。
[0069] 變體：術語"變體"意指在一個或多個（例如，若干個）位置處包含改變，即取代、 插入和/或缺失的具有酶或酶增強活性的多肽。取代意指占據(jù)一個位置的氨基酸替換不同 的氨基酸；缺失意指去除占據(jù)一個位置的氨基酸；并且插入意指在鄰接并且緊隨占據(jù)一個 位置的氨基酸之后添加一個氨基酸。
[0070] 在一個方面中，該變體與如在此鑒定的SEQ ID NO:的成熟多肽相差多達10個（例 如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個）氨基酸。在另一個實施例中，本 發(fā)明涉及在一個或多個（例如，若干個）位置處包括取代、缺失和/或插入的在此的SEQ ID NO:的成熟多肽的變體。在一個實施例中，引入在此的SEQ ID NO:的成熟多肽中的氨基酸 取代、缺失和/或插入的數(shù)目多達10,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。這些氨基酸變化可 以具有微小性質(zhì)，即，不會顯著地影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守氨基酸取代或插入； 典型地1-30個氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸殘 基；多達20-25個殘基的小接頭肽；或便于通過改變凈電荷或另一種功能來純化的小延伸。 [0071] 野生型酶：術語"野生型"酶意指由天然存在的微生物（如在自然界中發(fā)現(xiàn)的細 菌、酵母或絲狀真菌）表達的一種酶。
[0072] 研磨方法
[0073] 研磨籽粒，以便打開結構并且允許進一步加工并且將籽粒分離成四種主要成分： 淀粉、胚芽、纖維以及蛋白質(zhì)。
[0074] 在一個實施例中，使用濕磨方法。濕磨使胚芽與粗粉（淀粉顆粒和蛋白質(zhì)）很好 分離并且時常應用于平行生產(chǎn)糖漿的場所。
[0075] 本發(fā)明的諸位發(fā)明人已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，可以通過在如在此描述的方法中處理 作物籽粒而改進淀粉終產(chǎn)物的品質(zhì)。
[0076] 本發(fā)明的方法與傳統(tǒng)方法相比，產(chǎn)生了更高的淀粉品質(zhì)，因為淀粉終產(chǎn)物更純和/ 或獲得了更高的產(chǎn)量和/或使用更少的加工時間。另一種優(yōu)勢可以是可以減少需要使用的 化學品（例如S02和NaHS03)的量或甚至完全除去。
[0077] 濕磨
[0078] 淀粉是在植物細胞內(nèi)作為不溶于水的微小顆粒形式而形成。當放入冷水中時，這 些淀粉顆粒可以吸收少量的液體并膨脹。在高達約50°C至75°C的溫度下，膨脹可以是可逆 的。然而，在更高溫度下，開始不可逆膨脹，稱為"膠凝化"。有待根據(jù)本發(fā)明加工的顆粒狀 淀粉可以是含有粗淀粉的材料，該材料包括（例如，研磨的）全谷物，這些全谷物包括非淀 粉級分，如胚芽殘余物和纖維?？梢岳缤ㄟ^濕磨將原料（如全谷物）的粒度減少，以便打 開結構并允許進一步加工。濕磨使胚芽與粗粉（淀粉顆粒和蛋白質(zhì)）很好分離并且時常應 用于在例如糖漿的生產(chǎn)中使用淀粉水解物的場所。
[0079] 在一個實施例中，該粒度被減少至0. 05-3. 0mm、優(yōu)選0. 1-0. 5mm之間，或使得至少 30%、優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少70%、甚至更優(yōu)選至少90 %的含淀粉的材料適合通過一 個具有〇. 05-3. Omm篩網(wǎng)、優(yōu)選0. 1-0. 5mm篩網(wǎng)的篩子。
[0080] 更具體而言，將玉米籽粒以及其他作物籽粒降解為適于將淀粉轉化為單糖和寡 糖、乙醇、甜味劑等的淀粉基本由四個步驟組成：
[0081] 1.浸漬并分離胚芽，
[0082] 2.洗滌纖維并干燥，