特異性地阻滯腫瘤抗原的生物活性的抗體的制作方法
【專利說(shuō)明】特異性地阻滯腫瘤抗原的生物活性的抗體 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及特異性地結(jié)合KAAG1的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段和它們用于治 療某些疾病的用途，所述用途包括診斷、預(yù)防和治療與卵巢癌有關(guān)的惡性腫瘤。本發(fā)明也涉 及該些抗體用于診斷、預(yù)防和治療不同的其它癌癥類型的用途。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 在婦科惡性腫瘤中，卵巢癌占美國(guó)婦女中最高的腫瘤相關(guān)死亡率（Jemal等 人，2005)。它是美國(guó)婦女癌癥相關(guān)死亡的第四大主要原因（Menon等人，2005)。美國(guó)癌癥 學(xué)會(huì)（AmericanCancerSociety)估計(jì)在2005年共有22, 220個(gè)新病例，并將16, 210例死 亡歸因于該疾病炬onome等人，2005)。在過(guò)去的30年中，統(tǒng)計(jì)數(shù)字保持大致相同--大 多數(shù)出現(xiàn)卵巢癌的婦女將死于該疾?。ɑ痑mbers和Vanderhyden，2006)。該疾病具有1:70 終生危險(xiǎn)，且死亡率〉60%(化311166'3和￥3]1(161'117(16]1,2006)。高死亡率是由于難^早期 檢測(cè)卵巢癌，此時(shí)惡性腫瘤已經(jīng)擴(kuò)散至卵巢W外。實(shí)際上，〉80%的患者被診斷為晚期疾病 (III期或IV期）@onome等人，2005)。該些患者具有不良預(yù)后，該反映為<45%的5-年存 活率，盡管80 %至90 %在最初對(duì)化療有反應(yīng)炬erek等人，2000)。與早些年的20 % 5-年 存活率相比，該增加的成功至少部分地是由于最佳消脹（debulk)腫瘤組織的能力（當(dāng)腫 瘤組織被限制在卵巢中的時(shí)候），該是卵巢癌的重要預(yù)后因子炬ristowR.E.，2000;Brown 等人，2004)。在診斷出早期疾?。↖期）的患者中，5-年存活率范圍〉90(化ambers和 Vanderhyden, 2006)。
[0003] 卵巢癌包含不同的腫瘤組，它們?cè)醋月殉驳谋砻嫔掀せ虮砻姘w。它們分成血 清的、粘蛋白的、子宮內(nèi)膜樣的、透明細(xì)胞和布倫納（過(guò)渡）類型，對(duì)應(yīng)女性生殖道器官的 不同上皮類型（化化和Kurman, 2005)。在它們中，血清腫瘤占診斷出的卵巢癌病例的~ 60%。每個(gè)組織學(xué)子類進(jìn)一步分成3組；良性的、中間的（交界腫瘤或低惡性潛力（LMP)) 和惡性的，該反映了它們的臨床行為（Sei血an等人，2002)。LMP占診斷出的血清腫瘤的 10%至15%，且是一個(gè)難題，因?yàn)樗鼈儽憩F(xiàn)出非典型核結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)移行為，然而它們的侵入性 比高階血清腫瘤明顯更低。具有LMP腫瘤的患者的5-年存活率是95%，不同于晚期高階疾 病在相同時(shí)段中的<45 %存活率炬erek等人，2000)。
[0004] 現(xiàn)在，卵巢癌的診斷部分地通過(guò)患者醫(yī)學(xué)史的常規(guī)分析和通過(guò)進(jìn)行體檢、超聲檢 查和X-射線檢查和血液學(xué)篩查來(lái)完成。已經(jīng)為血清生物標(biāo)志物的早期血液檢測(cè)報(bào)道了 2 個(gè)替代策略。一個(gè)方案是，通過(guò)質(zhì)譜法分析血清樣品，W找到不明身份的蛋白或蛋白片段， 它們檢測(cè)癌癥的有無(wú)（Mor等人，2005 ;Kozak等人，2003)。但是，該策略是昂貴的，且不能 廣泛地得到?；蛘?，使用抗體微陣列、ELISA或其它類似方案，檢測(cè)血清中是否存在已知的 蛋白/膚。稱作CA-125(癌抗原-125)的蛋白生物標(biāo)志物的血清檢驗(yàn)長(zhǎng)期W來(lái)被廣泛地視 作卵巢癌的標(biāo)記物。但是，盡管卵巢癌細(xì)胞可能生成過(guò)量該樣的蛋白分子，一些其它的癌癥 具有高水平的CA-125,所述癌癥包括輸卵管癌或子宮內(nèi)膜癌（子宮的襯里的癌）、60%的膜 腺癌患者和20% -25%的其它惡性腫瘤患者。CA-125檢驗(yàn)僅返回約50%的I期卵巢癌患 者的真實(shí)陽(yáng)性結(jié)果，且具有80%的機(jī)會(huì)返回II、III和IV期卵巢癌患者的真實(shí)陽(yáng)性結(jié)果。 另外20%的卵巢癌患者沒(méi)有表現(xiàn)出CA-125濃度的任何增加。另外，升高的CA-125檢驗(yàn)可 能指示與癌癥無(wú)關(guān)的其它良性活性，諸如月經(jīng)、妊娠或子宮內(nèi)膜異位癥。結(jié)果，該檢驗(yàn)對(duì)于 仍然可治療的早期疾病的檢測(cè)而言具有非常有限的臨床用途，表現(xiàn)出<10%的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值 (PPV)。即使給CA-125附加超聲篩查，PPV僅提高至約20%化ozak等人，2003)。因而，該 檢驗(yàn)不是有效的篩查檢驗(yàn)。
[0005] 盡管具有提高的該疾病的病原學(xué)知識(shí)、侵入性細(xì)胞減數(shù)手術(shù)和現(xiàn)代組合化療，死 亡率僅有微小變化。差結(jié)果已經(jīng)歸因于：（1)缺少用于早期疾病檢查的適當(dāng)篩選檢驗(yàn)，W及 在該階段僅微弱的癥狀顯現(xiàn)--經(jīng)常只有在進(jìn)展至晚期后才能做出診斷，在此時(shí)癌癥的 腹膜擴(kuò)散會(huì)限制有效的治療，和（2)經(jīng)常出現(xiàn)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化療策略的耐受性，該限制了患者的 5-年存活率的提高。卵巢癌的初期化療方案包括卡波笛（伯爾定）和紫杉醇（泰素）的組 合。數(shù)年的臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)該組合在有效手術(shù)后是最有效的（在約80%的具有新診斷出 的卵巢癌的婦女中減小腫瘤體積，且40%至50%具有完全消退），但是繼續(xù)研究來(lái)尋找提 高它的方法。最近的化療劑腹部輸注來(lái)祀向難W達(dá)到的細(xì)胞與靜脈內(nèi)遞送的組合已經(jīng)增加 了有效性。但是，嚴(yán)重的副作用經(jīng)常導(dǎo)致不完全的療程。一些其它的化療劑包括多柔比星、 順笛、環(huán)磯醜胺、博來(lái)霉素、依巧泊巧、長(zhǎng)春堿、鹽酸拓?fù)涮婵?、異環(huán)磯醜胺、5-氣尿嚼巧和美 法侖。更近地，臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，與全身性靜脈內(nèi)化療相比，順笛的腹膜內(nèi)施用會(huì)提供生 存優(yōu)勢(shì)（Cannistra和McGuire, 2007)。接受化療的具有早期疾病的婦女的優(yōu)良存活率會(huì)為 開發(fā)提高卵巢癌檢測(cè)的策略的研究工作提供堅(jiān)固的理論。此外，新的卵巢癌有關(guān)的生物標(biāo) 志物的發(fā)現(xiàn)，會(huì)導(dǎo)致用于卵巢癌的將來(lái)治療的、具有最小副作用的更有效的治療策略的發(fā) 展。
[0006] 盡管在卵巢癌的理解和治療方面存在該些最近的進(jìn)步，化療的應(yīng)用總是伴有嚴(yán)重 的不良反應(yīng)，該限制了它們的應(yīng)用。結(jié)果，對(duì)更特異性的策略（諸如組合抗原組織特異性和 單克隆抗體的選擇性）的需要，會(huì)允許顯著減少脫祀相關(guān)的（off-target-associated)副 作用。單克隆抗體用于治療卵巢癌的應(yīng)用正在開始出現(xiàn)，具有日益增多的數(shù)目的進(jìn)行中的 臨床試驗(yàn)（Oei等人，2008 ;Nicodemus和berek, 2005)。該些試驗(yàn)中的大多數(shù)已經(jīng)檢查了 與放射性同位素（諸如紀(jì)-90)綴合的單克隆抗體的應(yīng)用，或祀向在其它癌癥類型中已經(jīng)鑒 別出的腫瘤抗原的抗體的應(yīng)用。一個(gè)該樣的實(shí)例是貝伐單抗的應(yīng)用，它祀向血管內(nèi)皮生長(zhǎng) 因子炬urger，2007)。存在非常少的卵巢癌特異性的抗原，它們目前處于作為單克隆抗體的 治療祀標(biāo)的研究中。一些實(shí)例包括稱作B7-H4的蛋白（Simon等人，2006)和更近的葉酸受 體-a巧bel等人，2007)的應(yīng)用，后者最近已經(jīng)進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)。
[0007] 最初從源自組織相容性白細(xì)胞抗原-B7腎癌細(xì)胞系的cDNA文庫(kù)克隆出腎相關(guān) 抗原1 (KAAG1)，作為呈遞給細(xì)胞毒性T淋己細(xì)胞的抗原膚（VandenEynde等人，1999 ; Genebank登記號(hào)Q9UBP8)。發(fā)現(xiàn)含有KAAGl的基因座編碼2個(gè)基因，它們?cè)趦蓚€(gè)方向轉(zhuǎn)錄到 相反鏈上。發(fā)現(xiàn)有義鏈編碼該樣的轉(zhuǎn)錄物，其編碼稱作DCDC2的蛋白。該些作者的表達(dá)研究 發(fā)現(xiàn)，KAAG1反義轉(zhuǎn)錄物是腫瘤特異性的，且在正常組織中表現(xiàn)出非常少的表達(dá)，而DCDC2 有義轉(zhuǎn)錄物普遍表達(dá)（VandenEynde等人，1999)。KAAG1轉(zhuǎn)錄物在癌癥、尤其是卵巢癌、腎 癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌和黑素瘤中的表達(dá)，公開在公布的專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/CA2007/001134 中。VandenEynde等人也觀察了在腎癌、結(jié)直腸癌、黑素瘤、肉瘤、白血病、腦腫瘤、甲狀 腺腫瘤、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、膀脫腫瘤、肺癌和頭和頸腫瘤中的RNA表達(dá)。最近，通 過(guò)連鎖不平衡研究得到的有力遺傳證據(jù)發(fā)現(xiàn)，VMP/DCDC2/KAAG1基因座與誦讀困難有關(guān) (Schumacher等人，2006 ;Cope等人，2005)。該些報(bào)告之一指向DCDC2標(biāo)志物作為誦讀困 難患者的原因，因?yàn)樵摰鞍自谄べ|(zhì)神經(jīng)元遷移中的功能與經(jīng)常表現(xiàn)出異常神經(jīng)元遷移和成 熟的該些患者的癥狀相一致（Schumacher等人，2006)。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[000引本發(fā)明涉及KAAG1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)。本發(fā)明也涉及特異性的抗-KAAG1抗體 和抗原結(jié)合片段W及可用于治療、檢測(cè)和診斷癌癥的試劑盒。所述抗體和抗原結(jié)合片段可 W更具體地用于治療、檢測(cè)和診斷其中腫瘤細(xì)胞表達(dá)KAAG1的癌癥，諸如卵巢癌、皮膚癌、 腎癌、結(jié)直腸癌、肉瘤、白血病、腦癌、甲狀腺癌、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、膀脫癌、肺癌W 及頭和頸癌。
[0009] 本發(fā)明在其一個(gè)方面提供了分離的或基本上純化的抗體或抗原結(jié)合片段，它們能 特異性地結(jié)合腎相關(guān)抗原1 (在SEQIDNO. :2中定義的KAAG1)或KAAG1變體。
[0010] 更具體地，且根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述抗體或抗原結(jié)合片段可W結(jié)合位 于KAAG1的氨基酸30和氨基酸84之間的結(jié)構(gòu)域。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，所述抗體或抗原結(jié)合片段能結(jié)合包含在KAAG1的 氨基酸1-35內(nèi)的表位。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案，所述抗體或抗原結(jié)合片段能結(jié)合包含在KAAG1的 氨基酸36-60內(nèi)的表位。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案，所述抗體或抗原結(jié)合片段能結(jié)合包含在KAAG1的 氨基酸61-84內(nèi)的表位。
[0014] 本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段尤其能特異性地結(jié)合分泌型KAAG1，目P，其中已經(jīng) 切掉信號(hào)膚的KAAG1形式。
[0015] 本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段尤其能結(jié)合KAAG1的胞外區(qū)域。
[0016] 該樣，本發(fā)明包括診斷和/或治療抗體或抗原結(jié)合片段，其具有對(duì)分泌型KAAG1或 KAAG1的胞外區(qū)域的特異性。本發(fā)明也包括具有與本發(fā)明抗體相同的表位特異性的抗體或 抗原結(jié)合片段。通過(guò)測(cè)定它是否結(jié)合本文所述抗體結(jié)合的表位，和/或通過(guò)與已知結(jié)合所 述表位的抗體或抗原結(jié)合片段進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)，可W鑒別候選抗體。
[0017] 因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其能與本文所述 的抗體或抗原結(jié)合片段競(jìng)爭(zhēng)。
[0018] 本發(fā)明的分離的抗體或抗原結(jié)合片段包括能誘導(dǎo)表達(dá)KAAG1的腫瘤細(xì)胞或表達(dá) KAAG1變體的腫瘤細(xì)胞的殺死（消除、破壞、裂解）（例如，WADCC-依賴性的方式）的那些。
[0019] 本發(fā)明的分離的抗體或抗原結(jié)合片段也包括特征在于它們的減少表達(dá)KAAG1的 腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散的能力的那些，W及特征在于它們的減少或損害表達(dá)KAAG1的腫瘤的形成 的能力的那些。
[0020] 當(dāng)KAAG1在表達(dá)KAAG1的腫瘤細(xì)胞的表面處表達(dá)時(shí)，所述抗體或抗原結(jié)合片段可 能是特別有效的，且可W具體地用于祀向特征在于不依賴于銷著生長(zhǎng)的表達(dá)KAAG1的腫瘤 細(xì)胞。
[0021] 本發(fā)明涉及具有本文所述特征的單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體 和人抗體（分離的）W及抗原結(jié)合片段。還一起包括該樣的抗體或抗原結(jié)合片段，其包括 單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體之間的輕鏈和/或重鏈的置換。
[0022] 本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段因而可W包含人恒定區(qū)的氨基酸和/或人抗體的 框架氨基酸。
[0023] 術(shù)語(yǔ)"抗體"是指完整抗體、單克隆抗體或多克隆抗體。術(shù)語(yǔ)"抗體"也包括多特 異性的抗體，諸如雙特異性的抗體。人抗體通常由2個(gè)輕鏈和2個(gè)重鏈組成，每個(gè)鏈包括可 變區(qū)和恒定區(qū)。輕鏈可變區(qū)包含3個(gè)側(cè)接框架區(qū)的CDR，在本文中鑒定為CD化1、CD化2和 CD化3。重鏈可變區(qū)含3個(gè)側(cè)接框架區(qū)的CDR，在本文中鑒定為CDRH1、CDR肥和CDR冊(cè)。
[0024] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"抗原結(jié)合片段"是指抗體的一個(gè)或多個(gè)片段，所述片段保留結(jié)合 抗原（例如，KAAG1、分泌型KAAG1或其變體）的能力。已經(jīng)證實(shí)，抗體的抗原結(jié)合功能可 W由完整抗體的片段來(lái)執(zhí)行。在術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合片段"中包括的結(jié)合片段的實(shí)例包 括；（i)F油片段，即由Vh、C訊Ch滿構(gòu)域組成的單價(jià)片段；（ii)F(油'）2片段，即包含2 個(gè)通過(guò)較鏈區(qū)中的二硫鍵連接起來(lái)的F油片段的二價(jià)片段；（iii)由Vh和Chi結(jié)構(gòu)域組成 的Fd片段；（iv)Fv片段，其由抗體的一條臂的V郝VH結(jié)構(gòu)域組成；(V)dAb片段（Ward等 人，（1989)化Uire341:544-546)，其由Vh結(jié)構(gòu)域組成；和（Vi)分離的互補(bǔ)性決定區(qū)（CDR), 例如，VhCDR3。此外，盡管Fv片段的2個(gè)結(jié)構(gòu)域\和￥?由分開的基因編碼，使用重組方 法，可W通過(guò)合成連接物連接它們，所述合成連接物使它們成為單個(gè)多膚鏈，在該個(gè)單個(gè)多 膚鏈中V許日Vh區(qū)配對(duì)，W形成單價(jià)分子（稱作單鏈Fv(scFv);參見例如，Bird等人（1988) Science242:423-426 ;和Huston等人（1988)Proc.化tl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。 該樣的單鏈抗體也意圖包括在術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合片段"內(nèi)。此外，抗原結(jié)合片段包括結(jié) 合-結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白，其包含：（i)與免疫球蛋白較鏈區(qū)多膚融合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域 多膚（諸如重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)或通過(guò)連接膚與輕鏈可變區(qū)融合的重鏈可變區(qū)），（ii) 與較鏈區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈C肥恒定區(qū)，和（iii)與C肥恒定區(qū)融合的免疫球蛋白重 鏈C