用于治療疾病的抗人sema4A抗體的制作方法
【專利說明】
[000。本申請是申請日為2012年10月5日，申請?zhí)枮?01280060448. 1，發(fā)明名稱為"用 于治療疾病的抗人sema4A抗體"的發(fā)明專利申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明主要設(shè)及人sema4A的調(diào)節(jié)，尤其設(shè)及抑制人sema4AW阻斷由抗CD3、抗 CD-28、IL-4、重組sema4A和樹突細胞誘導(dǎo)的增殖和化2分化W及治療疾病。
[0003] 相關(guān)申請的香叉引用
[0004] 本申請要求2011年10月6日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/543, 877的權(quán)益和 優(yōu)先權(quán)，其通過引用的方式并入本文。
[000引 關(guān)于巧巧咨巧的研究或開發(fā)的聲巧
[0006] 本發(fā)明是在由國立衛(wèi)生研究院授予的R01AI062888-01下由政府支持做出的。所 述政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
[0007] 巧合研究協(xié)巧參與方的名疏
[0008] 無
[0009] 對序列表的引用
[0010] 本公開包括作為2012年10月5日創(chuàng)建的，名稱為序列表.txt的，依照37C. 尸.尺.§1.52(6)(乂）的文本文件遞交的序列表，具有46，124字節(jié)大小，其通過引用并入 本文。所附序列描述和序列表遵守如37C.F.R. § § 1.821-1.825中所闡述的適用于 專利申請中的核巧酸和/或氨基酸序列公開的規(guī)則。所述序列表包含如符合Nucleic AcidsRes. 13:3021-3030(1985)和BiochemicalJ.219(No. 2) :：M5-373(1984)中描述的 lUPAC-IUBMB標(biāo)準(zhǔn)所定義的用于核巧酸序列特性的單字母代碼和用于氨基酸的S字母代 碼。用于核巧酸和氨基酸序列的符號和格式遵守37C.F.R. § 1.822中闡述的規(guī)則。
【背景技術(shù)】
[0011] 信號素類為大的、保守的分泌性或膜結(jié)合性配體家族，其對生長錐起排斥或吸引 提示的作用?；诠δ苡蚝托蛄邢嗨菩詫⑿盘査丶易宸殖蓙嗩?。Rice, D.，et al.，Severe Retinal Degeneration Associated with Disruption of Semaphorin 4A, Investigative Ophthalmology&Visual Science, Vol. 45, No. 8(2004)。Sema4A為第IV類信號素。在小鼠 中，有證據(jù)表明sema4A由骨髓來源的及脾臟DC W及由B細胞和活化的T細胞表達。sema4A 可通過其受體TIM2刺激T細胞增殖，其誘導(dǎo)IL-2產(chǎn)生并且據(jù)報道在用抗CD40單克隆抗體 刺激B細胞后上調(diào)。Kumanogoh,A.,et al.^^re,419:629-33,2002。已表明，sema4A缺 陷小鼠表現(xiàn)出有缺陷的Thl響應(yīng)。sema4A似乎參與了T細胞的引發(fā)W及化1/Th2響應(yīng)的調(diào) 節(jié)。Kumanogoh,A.et al. Immunity, 22:305-16, 2005。然而，迄今為止，sema4A在人免疫系 統(tǒng)中的生物學(xué)功能還沒有研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 人sema4A蛋白由抗原呈遞細胞，比如樹突細胞和活化的生發(fā)中屯、B細胞，w及 CD4+Th2細胞高表達。我們發(fā)現(xiàn)，重組的sema4A蛋白強烈地促進被IL-4、抗CD3、抗CD28和 重組的sema4A誘導(dǎo)的人CD4+T細胞增殖和Th2分化。同時，中和mAb可阻斷生物學(xué)功能。 同樣地，人sema4A(本文也稱為"hsema4A"或者更通常地稱為"sema4A"或"Sema4A")呈現(xiàn) 重要的和有利的治療祀點。
[0013] 本文提供了結(jié)合人sema4A的新的單克隆和人源化抗體。該些抗體在本文有時也 稱為"抗人sema4A抗體（anti-humansema4Aantibody)"或"抗人sema4A抗體（anti-human sema4Aantibodies)"，但是也可稱為分離的抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或簡 單抗體，如W單數(shù)或復(fù)數(shù)所呈現(xiàn)的。
[0014] 所教導(dǎo)的抗人sema4A抗體用于治療或預(yù)防急性或慢性疾病和病況。在一個方面， 結(jié)合人sema4A的分離的抗體，或其抗原結(jié)合部分被描述并且是有效的癌癥治療。所述抗人 sema4A抗體也可用于治療人自身免疫疾病、變應(yīng)性疾病、炎性疾病、移植物抗宿主疾病和移 植物排斥。
[001引還提供了基于人sema4A的該些抗體結(jié)合劑的組合物、方法、試劑盒和制品。該些 抗人sema4A抗體可為治療和/或診斷劑并用于祀向與人sema4A和其受體人免疫球蛋白樣 轉(zhuǎn)錄物40iILT-4)、人T細胞免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和人粘蛋白結(jié)構(gòu)域3化TIM-3)和人免疫球蛋 白樣轉(zhuǎn)錄物2化ILT-2)信號途徑的表達和/或活性相關(guān)的病理狀況。
[0016] 此外，如本文描述的分離的抗體結(jié)合人sema4A，并可結(jié)合由下列基因編碼的人 sema4A;NCBI登錄號HGNC: 10729,Genpept登錄號64218,或者與其具有百分之90同源性 的基因。本文提供的分離的抗體還可結(jié)合具有下列GenBank登錄號之一的人sema4A受體； 10288、84868 和 10859。
[0017] 如本文所提供的，示例性的結(jié)合人sema4A的分離的抗體包括；(a)包含SEQID NO:36的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR1 ; (b)包含SEQIDNO:37的氨基酸序列的重鏈可變 區(qū)CDR2 ; (C)包含SEQIDN0:38的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR3 ; (d)包含SEQIDNO. 48 的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDRl; (e)包含SEQIDNO. 49的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū) CDR2 ;W及（f)包含SEQIDNO. 50的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR3。
[0018] 此外，結(jié)合人sema4A的分離的抗體的另一實例包括；（a)包含SEQIDNO: 54的氨 基酸序列的重鏈可變區(qū)CDRl;(b)包含SEQIDN0:55的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR2;(c) 包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR3 ; (d)包含SEQIDNO. 66的氨基酸序 列的輕鏈可變區(qū)CDR1 ; (e)包含SEQIDNO. 67的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;W及（f) 包含SEQIDNO. 68的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR3。
[0019] 或者，分離的抗體可具有包含SEQIDN0:36或54的氨基酸序列的重鏈可變區(qū) CDR1;包含SEQIDN0:37或55的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR2;和/或包含SEQIDN0:38 或56的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR3,或與其具有百分之90同源性的重鏈可變區(qū)CDR。
[0020] 而且，分離的抗體可具有包含SEQIDN0:48或66的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū) CDR1;包含SEQIDN0:49或67的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR2;和/或包含SEQIDN0:50 或68的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR3,或與其具有百分之90同源性的重鏈可變區(qū)CDR。
[0021] 所述分離的抗體可具有包含SEQIDNO: 51或69的氨基酸序列，或者包含與SEQID NO:51或69的氨基酸序列具有至少百分之90同一性的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)（"化")。 所述分離的抗體可具有包含569 10^:39、45、57或63的氨基酸序列，或者包含與569 10N0:39、45、57或63的氨基酸序列具有至少百分之90同一性的氨基酸序列的重鏈可變區(qū) ("VH")。同樣地，作為實例，所述分離的抗體可包含SEQIDNO:39、45、57或63的重鏈可 變序列和SEQIDNO:51的輕鏈可變序列，或者與其具有百分之90同源性的序列。類似地， 所述分離的抗體可具有SEQIDNO:39、45、57或63的重鏈可變序列和SEQIDNO:69的輕 鏈可變序列或與其具有百分之90同源性的序列。
[002引所述分離的抗體可具有由SEQIDNO: 52或70的核酸序列，或與SEQIDNO: 52或 70的核巧酸序列具有至少百分之90同一性的核酸序列編碼的可變輕鏈。所述分離的抗體 可具有由SEQIDN0:40、46、58或64的核酸序列，或與SEQIDN0:40、46、58或64的核巧 酸序列具有至少百分之90同一性的核酸序列編碼的可變重鏈。
[0023] 本文還提供了單克隆抗體。所述單克隆抗體可具有包含SEQIDNO:73、75或77 的氨基酸序列，或者包含與SEQIDNO:73、75或77的氨基酸序列具有至少百分之90同一 性的氨基酸序列的可變輕鏈。還提供了具有包含SEQIDN0:72、74或76的氨基酸序列，或 者包含與SEQIDN0:72、74或76的氨基酸序列具有至少百分之90同一性的氨基酸序列的 可變重鏈的單克隆抗體。
[0024] 其它抗體可具有下列部件的任何一種或多種；可變輕鏈；可變重鏈；或重鏈或輕 鏈可變區(qū)CDR1、CDR2或CDR3,每個部件均包含如本文描述的和在序列表中標(biāo)識的SEQID NO: 1直到77的氨基酸或核酸序列，或者包含與SEQIDNO: 1直到77的序列之一具有至少 百分之90同一性的氨基酸或核酸。
[00巧]本文還提供編碼本文教導(dǎo)的任何抗人sema4A抗體的分離的核酸。本文還提供包 含編碼本文描述的任何抗人sema4A抗體的核酸的宿主細胞。還提供產(chǎn)生抗體的方法（比 如包含編碼本文描述的任何抗sema4A抗體的核酸的宿主細胞）包括培養(yǎng)所述宿主細胞W 便抗體產(chǎn)生，和/或從所述宿主細胞回收抗體。
【附圖說明】
[0026] 為了獲得且能夠更詳細地理解其中本發(fā)明的上文列舉的特征、方面和優(yōu)勢W及其 它將變得顯而易見的方式，通過參照本發(fā)明的實施方案而可能具有上文簡要概括的本發(fā)明 的更加特定的描述，該些實施方案圖示在形成該說明書一部分的附圖中。然而，要注意的 是，附圖僅僅示出本發(fā)明的一些實施方案，并且因此不被視為本發(fā)明的范圍的限制，因為本 發(fā)明可承認(rèn)其它同樣有效的實施方案。
[0027] 圖1A，1A1，1B和1C顯示sema4A在人血C的表達。
[002引圖2A和2B提供人扁桃體中的sema4A的免疫組織學(xué)染色。
[0029] 圖3A和3B描繪抗人sema4A單克隆抗體阻斷血C和T細胞之間的相互作用。
[0030] 圖4A，4B，4C和4D顯示sema4A增強CD4+幼稚T細胞增殖。
[003。圖5A，5B，5C，抓和祀顯示抗人sema4A單克隆抗體在TCR觸發(fā)下阻斷sema4A介 導(dǎo)的CD4+T細胞增殖。
[0032] 圖6A，6B，6C和抓顯示sema4A調(diào)節(jié)化2致敏的CD4+化的化2細胞因子分泌。
[0033] 圖7A，7B，7C和7D顯示sema4A在T細胞活化和化2培養(yǎng)條件下上調(diào)CRT肥+記憶 Th2細胞產(chǎn)生Th2細胞因子和下調(diào)Thl細胞因子。
[0034]圖8A，8B，8C，8D，8E，8F，8G，細和81顯示抗sema4A單克隆抗體在CD4+Th2細胞中 抑制由sema4A誘導(dǎo)的化2細胞因子（比-4, IL-5和IL-13)產(chǎn)生。
[003引圖9顯示第一批的抗人sema4A單克隆抗體的鑒定。
[0036]圖10A，10B，10C，10D和10E顯示抗人sema4A單克隆抗體克隆號126-65,126-28 和126-63的功能測定結(jié)果。
[0037] 圖11A，11B，11C和11D顯示抗人sema4A單克隆抗體克隆號126-25和126-31的 功能測定結(jié)果。
[003引圖12顯示第二批的抗人sema4A單克隆抗體的鑒定。
[0039]圖13顯示抗人sema4A單克隆抗體克隆號161-70-1，161-90,161-96B，161-110B， 161-117,161-118A和161-66的功能測定結(jié)果。
[0040]圖14顯示抗人sema4A單克隆抗體克隆號161-15B，161-18B，161-33,161-35， 161-44,161-49和161-51的功能測定結(jié)果。
[0041] 圖15顯示結(jié)合L/sema4A的LB70抗體的分析結(jié)果。
[004引圖16A和16B顯不結(jié)合L/sema4A的LB51抗體的分析結(jié)果。
[004引圖17A和17B顯示抗人Sema4A mAb陽性克隆檢測PMBC上擲猴Sema4A的表達。
[0044] 圖18A，18B，18C和18D顯示針對hSema4A的兩株人源化mAb的分析結(jié)果。
[0045] 圖19A和19B顯示sema4A受體克隆與人T細胞表達cDNA文庫篩選。
[0046] 圖20A和20B顯示sema4A受體結(jié)合sema4A轉(zhuǎn)染的細胞系。
[0047] 圖21A和21B顯示受體-化融合蛋白阻斷由rhSema4A介導(dǎo)的人CD4+T細胞增殖。
[0048] 圖22A，22B和22C顯示sema4A在人哮喘肺組織中特異性過表達。
[0049] 圖23顯示小鼠161-51-1VH cDNA的核巧酸序列連同所導(dǎo)出的氨基酸序列。該圖 還提供W單字母代碼顯示的氨基酸殘基。信號膚序列為斜體。成熟VH的N端氨基酸殘基 (曲為雙下劃線和黑體。根據(jù)K油at et al. (1991)的定義的CDR序列為下劃線的。
[0050] 圖24顯示小鼠161-51-1化cDNA的核