綠盲蝽水溶性海藻糖酶單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及抗體工程農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種綠盲睹水溶性海藻糖酶單 克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 綠盲睹Apolyguslucorum化emiptera:Miridae)屬半翅目盲睹科，是棉花、蔬菜、 果樹、牧草等多種農(nóng)作物上的重要害蟲。近年來，由于轉(zhuǎn)化基因棉的大面積種植和農(nóng)業(yè)產(chǎn) 業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整等原因，綠盲睹種群數(shù)量急劇上升，加之長期依賴化學(xué)農(nóng)藥防治，致使綠盲睹 的抗藥性日漸增強(qiáng)，目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的綠盲睹防控面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，急待開拓減少化學(xué)農(nóng)藥 使用的新型無公害防控手段。迄今，多種新型昆蟲生長調(diào)節(jié)劑已應(yīng)用到防治綠盲睹的危害 中，如氣鈴脈等第=代殺蟲劑，顯示出較好的殺蟲效果。但是，由于該些農(nóng)藥的特異性祀標(biāo) 表達(dá)量的差異，可顯著影響其藥效。水溶性海藻糖酶（solubletrehalase，Tre-1)是多種 昆蟲生長調(diào)節(jié)劑的祀標(biāo)基因，也是綠盲睹體內(nèi)一種重要的水解酶。綠盲睹水溶性海藻糖酶 (AlTre-1)基因在不同齡期、不同組織中的蛋白表達(dá)量均不相同，導(dǎo)致昆蟲生長調(diào)節(jié)劑施用 后，對祀標(biāo)基因水溶性海藻糖酶的抑制效果出現(xiàn)較大差異，從而可引起農(nóng)藥的使用效果下 降。因此要求有靈敏度高，特異性好的蛋白檢測技術(shù)來分析綠盲睹體內(nèi)水溶性海藻糖酶的 表達(dá)量，指導(dǎo)該些昆蟲生長調(diào)節(jié)劑的使用時(shí)間。目前，應(yīng)用在昆蟲蛋白檢測的方法主要有 E化SA和Westernblot。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 發(fā)明目的；本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種綠盲睹AlTre-1單克隆抗體。
[0004] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種綠盲睹AlTre-1單克隆抗體的制備方法。
[0005] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種綠盲睹AlTre-1單克隆抗體的化LSA檢測方法。
[0006] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種綠盲睹AlTre-1單克隆抗體的Westernblot檢 測方法。
[0007] 本發(fā)明的又一目的是提供一種綠盲睹AlTre-1單克隆抗體的抗體特異性檢測方 法。
[0008] 技術(shù)方案；為了解決上述問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種綠盲睹AlTre-1單 克隆抗體，將重組AlTre-1蛋白抗原免疫小鼠后制得。
[0009] 一種綠盲睹AlTre-1單克隆抗體的制備方法，包括W下步驟：
[0010]a、抗原處理：取純化后的重組AlTre-1蛋白抗原與等體積弗氏完全佐劑混勻乳化 得到首次免疫抗原；弗氏不完全佐劑和重組AlTre-1蛋白抗原等體積混合得到第二、=和 四次免疫抗原；
[0011]b、動物免疫；采用皮下多點(diǎn)注射法免疫6-8周齡雌性BALB/c小鼠；首次免疫采用 首次免疫抗原；間隔21天后第二次免疫采用第二次免疫抗原；間隔35天后第=次免疫采 用第=次免疫抗原；間隔49天后第四次免疫采用第四次免疫抗原，末次免疫后第7天，耳靜 脈采血1ml，ELISA檢測抗血清效價(jià)，選取效價(jià)大于1:10000的2只小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合過程 中脾細(xì)胞的制備；
[0012] C、骨髓瘤細(xì)胞的制備；于細(xì)胞融合前一周，用含10%FBSDMEM的培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng) SP2/0細(xì)胞。在融合當(dāng)天收集SP2/0細(xì)胞，100化pm，5min離屯、后棄上清，然后加入20mlDMEM 培養(yǎng)基，吹散細(xì)胞后計(jì)數(shù)；
[0013]t脾細(xì)胞的制備；將上述b過程中選取的小鼠在融合前3天終免，于腹腔注射抗原 100yg，融合當(dāng)天用頸椎脫白法安樂死要融合的小鼠，75 %酒精浸泡5min后無菌取脾臟， 把脾臟放入內(nèi)有10mlDMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，取篩網(wǎng)放入另一個(gè)平皿中，將脾臟轉(zhuǎn)移到篩 網(wǎng)上，用注射器內(nèi)屯、研磨脾臟，加入DMEM到篩網(wǎng)上，沖洗篩網(wǎng)，使脾細(xì)胞更多的收集到平皿 中，將細(xì)胞移至10ml離屯、管中，用不含血清的DME：M洗脾細(xì)胞兩次，100化pm離屯、5min后收 集脾細(xì)胞計(jì)數(shù)；
[0014]e、細(xì)胞融合；混合骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞，使骨髓瘤細(xì)胞同脾細(xì)胞數(shù)量比在1 ; 20,用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋混合細(xì)胞，100化pm離屯、5min后棄上清，將細(xì)胞均勻后加入 0. 8ml50%陽G，反應(yīng)90秒，再加入25mlDMHM培養(yǎng)基后37°C水浴鍋中反應(yīng)lOmin，1000巧111 離屯、5min后棄上清，加入HATDMEM培養(yǎng)基，然后將融合的細(xì)胞鋪到96孔板中，每孔 100y1，然后將細(xì)胞培養(yǎng)板放到C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，融合后4天查看，雜交瘤細(xì)胞克隆率達(dá) 到50%W上，細(xì)胞生長狀態(tài)良好。融合10天后開始進(jìn)行篩選檢測；
[0015]f、融合篩選：于檢測的前一天，用PBS包被5yg/ml抗原于化ISA板后過夜。次日 吸取細(xì)胞上清100y1/孔進(jìn)行ELISA檢測，根據(jù)ELISA結(jié)果，判斷陽性孔，W樣品孔OD值/ 陰性孔OD值> 2. 1時(shí)，則判定為陽性孔，用單道移液器挑檢整板檢測出的陽性孔，進(jìn)行第二 次確認(rèn)檢測，進(jìn)一步確認(rèn)陽性孔，確定后的陽性孔細(xì)胞進(jìn)行亞克隆；
[0016]g、亞克?。捍荡蜿栃钥字屑?xì)胞后計(jì)數(shù)，加入N/4mlDMEM培養(yǎng)基（N為細(xì)胞數(shù)），取 100y1陽性孔細(xì)胞懸液到離屯、管中，吹勻后留1ml，補(bǔ)加DMEM到4ml后吹勻，留100y1在管 底，加入DMEM至5ml，混勻后滴加至96孔板的A、B、CS行，每孔一滴，管底留1. 8~2. 0ml 左右，補(bǔ)加DMEM至5ml，吹勻后滴加至96孔板的D、E、FS行，每孔一滴，管底留1. 5~1. 8ml 左右，補(bǔ)加DMEM至3ml，吹勻后滴加至96孔板的G、H行，每孔一滴，7~10天后在顯微鏡下 觀察，檢測有克隆生長的孔，標(biāo)記出單克隆的孔，挑取陽性單克隆細(xì)胞進(jìn)行再次亞克隆，檢 測至100%陽性后，挑出單克隆孔擴(kuò)大培養(yǎng)定株，從而獲得單克隆抗體。
[0017] 其中，上述步驟b中的首次、第二、S或四次免疫抗原劑量均為lOOyg/只。
[0018] 本發(fā)明中采用的重組AlTre-1蛋白的專利號為化201310227473. 0,發(fā)明名稱為 "一種綠盲睹水溶性海藻糖酶、其編碼序列、載體和菌株及應(yīng)用"中的制備方法制備得到的。
[0019] 一種綠盲睹AlTre-1單克隆抗體的化ISA檢測方法，包括W下步驟：用碳酸鹽包 被重組AlTre-1蛋白抗原，包被濃度為5yg/ml，4°C解育過夜，取出抗原后用PBST洗漆液 洗漆S次，然后加入封閉液，取出再用PBST洗漆液洗漆S次，將小鼠血清（一抗）首先按照 1:500稀釋，然后3倍稀釋，37°C解育1小時(shí)；取出用PBST洗漆液洗漆S次，加入辣根酶標(biāo) 記兔抗小鼠-HRP(二抗），1:5000稀釋，37°C解育60min;取出用PBST洗漆液洗漆四次，3分 鐘/次，最后加入TMB顯色液100y1/孔，反應(yīng)15min，加入100y1Imol/L鹽酸終止反應(yīng)， 在450nm波長下測定0D值，評價(jià)效價(jià)。
[0020] -種綠盲睹AlTre-1單克隆抗體的Westernblot檢測方法，包括W下步驟：取 AlTre-1重組蛋白按梯度上樣，上樣完畢后，聚丙締酷胺凝膠先75V跑完積層膠，再將電壓 升至115V直到電泳結(jié)束，電泳結(jié)束后，取下凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，恒壓100V轉(zhuǎn)膜1. 5小時(shí)。電轉(zhuǎn) 結(jié)束后，取下膜后先用PBS洗漆4次，每次5分鐘，然后置于37°C，5%脫脂奶粉封閉液中封 閉1小時(shí)。用封閉液稀釋一抗，膜在一抗稀釋液中37°C反應(yīng)1小時(shí)，洗膜4次，每次5分鐘， 用含5%牛奶的封閉液稀釋二抗，膜在二抗中37°C反應(yīng)1小時(shí)，洗膜E化顯影。
[0021] 一種綠盲睹AlTre-1單克隆抗體的抗體特異性檢測方法，包括W下步驟；取綠盲 睹若蟲提取總蛋白，通過RIPA裂解獲得上清，按梯度上樣采用聚丙締酷胺凝膠電泳，電泳 結(jié)束后，取下凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，取下膜后先用PBS緩沖液洗漆，然后將膜置于封閉液中封閉， 然后用封閉液稀釋一抗，膜在一抗稀釋液中反應(yīng)，洗膜，封閉液稀釋二抗，膜在二抗中反應(yīng)， 洗膜E化顯影。
[0022] 本發(fā)明采用的封閉劑為脫脂奶粉。
[0023] 有益效果：本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有W下優(yōu)點(diǎn)：將原核表達(dá)純化的AlTre-1 單重組蛋白應(yīng)用于免疫小鼠后制備了單克隆抗體，在通過利用ELISA法確定了該多克隆 抗體的效價(jià)后，發(fā)明人采用Western blot法發(fā)現(xiàn)該單克隆抗體能特異性識別原核表達(dá)的 AlTre-1重組蛋白，可產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)?；诖?，發(fā)明人還建立了一套高效、高靈敏度和 準(zhǔn)確的Western bl