一種攜帶抗Her2/CD3雙特異性功能蛋白的人T細(xì)胞制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種雙特異性抗體。
【背景技術(shù)】
[0002] 雙特異性抗體：由兩種抗體直接連接而成，目前常見的制備方法如下：參考文獻(xiàn) PNAS, 2013, 110(1) : 270-275.
[0003] 首先利用PCR制備雙特異性抗體基因，再將此基因克隆到表達(dá)載體PRB199轉(zhuǎn)化 到大腸桿菌菌株化21(ADE3)。細(xì)菌接種到含80yg/ml氯霉素的肉湯培養(yǎng)基中，在37°C 培養(yǎng)，至A600處吸光度達(dá)2.0。在培養(yǎng)基中加入0.ImM異丙基-e-D-硫代半乳糖巧（is oproP5d0 -D-1-thiogalactopyranoside)誘導(dǎo)重組雙特異性抗體的表達(dá)，繼續(xù)在37°C培 養(yǎng)化。菌液在2000g離屯、15分鐘，收集細(xì)菌，并用TE50/20緩沖液[50mMTris(pH7. 5) and20mM邸TA]重懸細(xì)菌，儲存于-70°C。使用大量TE50/20緩沖液洗漆細(xì)菌，制備包涵體 (Inclusionbodies)。隨后，在包涵體中加入6Mguanidine-HCl和DET(dithioer}ftbitol) 進(jìn)行變性，然后使用到復(fù)性緩沖液（0.1MTris，0.5Marginine-HCl，0.9mMoxidized glutathione,and2mM邸TA;pH10.3)進(jìn)行100稀釋，在4°C快速混合，隨后在4°C解育 72h，使蛋白重新折疊。復(fù)性后，W1:10的比例加入0. 1MTris和0. 5M化Cl進(jìn)行透析，重 復(fù)=次后進(jìn)行過濾（0. 2ym)，隨后進(jìn)行金屬離子親和層析。隨后，采用快速蛋白液相色譜儀 炬ioLogicDuoFlow10System;Bi〇-Rad)進(jìn)行純化，采用組氨酸標(biāo)簽融合蛋白質(zhì)純化柱分 離bscEGFRvIIIxCD3。上樣速度恒流控制在2毫升/分鐘，然后用0. 1MTris和0. 5M化C1 進(jìn)行清洗，直到280nm液吸光度的洗出液為0。蛋白質(zhì)是由咪挫逐步梯度洗脫，流速1毫升 /分鐘。將該產(chǎn)物進(jìn)行過柱（SartoriusStedimBiotech)處理，去掉分子量大于10000的 蛋白，用PBS透析，過濾除菌。測定濃度后使用SDS/PAGE進(jìn)行銀染鑒定。
[0004] 其中有一類叫雙特異性T細(xì)胞連接子炬ispecific T-cell化gager，BiTE)，因其 一端特異性抗T細(xì)胞表達(dá)的CD3分子而得名。
[0005] 化r2單抗治療；如Tras化zum油化erceptin)已在部分化r陽性的腫瘤治療中取 得了一定的療效，但由于效應(yīng)性免疫細(xì)胞的缺失，單純的抗體治療腫瘤難W完全清楚殘余 腫瘤細(xì)胞進(jìn)而防止腫瘤復(fù)發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于W上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種雙特異性抗體，用于 解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。本發(fā)明所提供的一種雙特異性抗體由=部分組成；抗腫瘤抗原的 抗體段、連接段和抗人CD3分子的抗體段，通過腫瘤抗原抗體段連接腫瘤細(xì)胞，同時(shí)抗CD3 抗體段連接T淋己細(xì)胞，從而有效將效應(yīng)性免疫細(xì)胞趨化到腫瘤局部，使機(jī)體更有效地發(fā) 揮抗腫瘤效應(yīng)。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供一種雙特異性抗體，所述 雙特異性抗體包括第一抗體段和第二抗體段，所述第一抗體段為抗腫瘤抗原抗體段，第二 抗體段為抗人CD3分子抗體段。
[000引優(yōu)選的，所述雙特異性抗體為單鏈雙特異性抗體。
[0009] 優(yōu)選的，所述抗腫瘤抗原抗體段為抗化r2抗體。
[0010] 更優(yōu)選的，所述抗化r2抗體的化氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示，所述抗化r2 抗體的VH氨基酸序列如SEQIDNo. 4所示。
[0011] 更優(yōu)選的，所述抗化r2抗體的化核巧酸編碼序列如SEQIDNo. 1所示，所述抗 化r2抗體的VH核巧酸編碼序列如SEQIDNo. 3所示。
[0012] 更優(yōu)選的，所述抗化r2抗體的化和VH之間通過連接段2連接，所述連接段2的 氨基酸序列選自SEQIDNo. 5-7中的一種。
[0013] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述抗腫瘤抗原抗體段從N端到C端依次包括抗化r2抗體 的化、連接段2、抗化r2抗體的VH，其氨基酸序列如SEQIDNo. 21、23、25所示，核巧酸編碼 序列如SEQIDNo. 20、22、24 所示。
[0014] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述抗腫瘤抗原抗體段從N端到C端依次包括抗化r2抗體 的VH、連接段2、抗化r2抗體的化，其氨基酸序列如SEQIDNo. 27所示，核巧酸編碼序列如 SEQIDNo. 26 所示。
[0015] 優(yōu)選的，所述抗人CD3分子抗體段的化氨基酸序列如SEQIDNo. 9所示，所述抗 人CD3分子抗體段的VH氨基酸序列如SEQIDNo. 11所示。
[0016] 優(yōu)選的，所述抗人CD3分子抗體段的化核巧酸編碼序列如SEQIDNo. 8所示，所 述抗人CD3分子抗體段的VH核巧酸編碼序列如SEQIDNo. 10所示。
[0017] 更優(yōu)選的，所述抗人CD3分子抗體段的化和VH之間通過連接段3連接，所述連接 段3的氨基酸序列如SEQIDNo. 12所示。
[001引在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述抗人CD3分子抗體段從N端到C端依次包括抗人CD3分 子抗體段的VH、連接段3、抗人CD3分子抗體段的化，其氨基酸序列如SEQIDNo. 29所示， 核巧酸編碼序列如SEQIDNo. 28中第1-744位所示。
[0019] 更優(yōu)選的，所述第一抗體段和第二抗體段之間通過連接段1連接。
[0020] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述連接段1的氨基酸序列如SEQIDNo. 13或SEQIDNo. 14所 /J、- o
[0021] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述雙特異性抗體從N端到C端依次包括第一抗體段、連 接段1、第二抗體段，其氨基酸序列如SEQIDNo. 31、33、35、37、39、41、43、45所示，核巧酸 編碼序列分別如SEQIDNo. 30 第 1-1560 位、SEQIDNo. 32 第 1-1560 位、SEQIDNo. 34 第 1-1560 位、SEQIDNo. 36 第 1-1545 位、SEQIDNo. 38 第 1-1533 位、SEQIDNo. 40 第 1-1566 位、SEQIDNo. 42 第 1-1551 位、SEQIDNo. 44 第 1-1539 位所示。
[0022] 本發(fā)明第二方面提供一種多核巧酸，所述多核巧酸編碼所述的雙特異性抗體。
[0023] 本發(fā)明第=方面提供一種含有所述多核巧酸的構(gòu)建體。
[0024] 優(yōu)選的，所述構(gòu)建體由所述多核巧酸插入到表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建而成。
[00巧]更優(yōu)選的，所述表達(dá)載體選自pGEM、祀LNS、pMSGV中的一種或多種的組合。
[0026] 本發(fā)明第四方面提供一種重組的宿主細(xì)胞，所述重組的宿主細(xì)胞含有所述的構(gòu)建 體、或者染色體中整合有所述的多核巧酸。
[0027] 優(yōu)選的，所述重組的宿主細(xì)胞由所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞構(gòu)建而成。
[002引優(yōu)選的，所述宿主細(xì)胞為T細(xì)胞。
[0029] 本發(fā)明第五方面提供所述雙特異性抗體的制備方法，包括如下步驟；在適合表達(dá) 所述雙特異性抗體的條件下，培養(yǎng)所述重組的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出所述的雙特異性抗體， 純化分離出所述的雙特異性抗體。
[0030] 本發(fā)明第六方面提供所述雙特異性抗體、多核巧酸、構(gòu)建體、重組的宿主細(xì)胞在制 備或篩選治療化r2陽性腫瘤藥物上的用途。
[0031] 例如，人胃癌細(xì)胞株N87、人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、人乳腺癌細(xì)胞株S邸R3、BT474該 些是化r2陽性的，人白血病細(xì)胞株K562、人乳腺癌細(xì)胞株MDA231、MDA468、MCF3為化r陰 性的
[0032] 優(yōu)選的，所述化r2陽性腫瘤選自人胃癌細(xì)胞株N87、人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、人乳 腺癌細(xì)胞株S邸R3、BT474中的一種或多種的組合。
[0033] 具體的，所述重組的宿主細(xì)胞在制備或篩選治療化r2陽性腫瘤藥物上的用途具 體為攜帶所述雙特異性抗體基因的T細(xì)胞在制備或篩選過繼轉(zhuǎn)輸治療化r2陽性腫瘤藥物 上的用途。
[0034] 本發(fā)明第走方面一種藥物組合物，包括治療有效量的所述雙特異性抗體或重組的 宿主細(xì)胞。
[0035] 該種組合物W所述雙特異性抗體為活性成分，加上本領(lǐng)域一種或多種藥物可接受 的載體、稀釋劑、填充劑、結(jié)合劑及其它賦形劑。
[0036] 本發(fā)明發(fā)明人利用雙特異性抗體原理，構(gòu)建化r2腫瘤抗原和T細(xì)胞特異性的雙特 異性抗體，利用過繼轉(zhuǎn)輸?shù)腡細(xì)胞攜帶并體內(nèi)持續(xù)表達(dá)該抗體蛋白，從而使該雙特異性抗 體在體內(nèi)發(fā)揮殺傷作用的同時(shí)，伴隨足量的T效應(yīng)細(xì)胞，更優(yōu)化了效應(yīng)發(fā)揮的效率。
[0037] 如上所述，本發(fā)明構(gòu)建化r2腫瘤抗原和T細(xì)胞特異性的雙特異性抗體，利用過繼 轉(zhuǎn)輸?shù)腡細(xì)胞攜帶并體內(nèi)持續(xù)表達(dá)該抗體蛋白，具有W下有益效果：
[003引 a)祀向性：制備攜帶針對化r2陽性腫瘤雙特異性抗體的效應(yīng)性T細(xì)胞，過繼轉(zhuǎn)輸 體內(nèi)治療腫瘤祀向性更好。
[0039] b)有效性；雙特異性抗體RNA基因電轉(zhuǎn)入T細(xì)胞后，會W分泌的形式表達(dá)，在體內(nèi) 更有利于結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面抗原，將腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞拉近，從T細(xì)胞更有效發(fā)揮殺傷效 應(yīng)。
[0040]C)安全性；雙特異性抗體RNA基因電轉(zhuǎn)入T細(xì)胞體內(nèi)，過繼轉(zhuǎn)輸該群基因修飾的 T細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)后，待效應(yīng)發(fā)揮后基因會被及時(shí)清除，而不會像慢病毒轉(zhuǎn)染那樣在體內(nèi)長期 存在，該樣安全性更佳。
【附圖說明】
[004U圖1顯示為輕鏈段huMAb4D5-5化和重鏈段huMAb4D5-5VH示意圖。
[00創(chuàng)圖2 (a)顯示為本發(fā)明