A納米顆粒的活化:利用5mg/mL的1-乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺混合溶劑室溫活化PLGA納米顆粒Ih ;
[0047](4)PLGA納米顆粒連接抗體:將活化后的納米材料離心收集，然后用0.1M、pH =8.0的杜氏磷酸鹽緩沖溶液洗滌納米材料I次，將需要連接的CD3和Mucl單抗等量混合加入到連接反應(yīng)液，然后用含有所述第一抗體部分和第二抗體部分的連接反應(yīng)液重懸納米材料，室溫連接反應(yīng)0.5h，反應(yīng)結(jié)束后離心收集納米材料，用杜氏磷酸鹽緩沖溶液洗滌納米材料2次，然后再重懸到杜氏磷酸鹽緩沖溶液中放4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0048]實施例2
[0049]能聯(lián)合免疫細(xì)胞增強腫瘤靶向殺傷能力的雙特性抗體，其制備方法如下:
[0050](I) PLA納米顆粒的制備:利用丙酮將PLA完全溶解至濃度為15mg/mL，按照丙酮和去離子水1:4的體積比，在500rpm/min磁力攪拌的狀態(tài)下將PLA與丙酮的溶液加入去離子水中，形成均勻的乳濁液，然后繼續(xù)攪拌至丙酮揮發(fā)；
[0051](2) PLA納米顆粒的收集:8000rpm/min離心收集制備的納米顆粒，然后用去離子水重懸，重復(fù)操作2次洗滌納米顆粒；
[0052](3)PLA納米顆粒的活化:利用lmg/mL的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺混合溶劑室溫活化PLA納米顆粒0.5h ;
[0053](4)PLA納米顆粒連接抗體:將活化后的納米材料離心收集，然后用0.1Μ、ρΗ = 8.0的杜氏磷酸鹽緩沖溶液洗滌納米材料一次，將需要連接的CD3單抗和CD19單抗等量混合加入到連接反應(yīng)液，然后用含有所述第一抗體部分和第二抗體部分的連接反應(yīng)液重懸納米材料，室溫連接反應(yīng)5h，反應(yīng)結(jié)束后離心收集納米材料，用杜氏磷酸鹽緩沖溶液洗滌納米材料2次，然后再重懸到杜氏磷酸鹽緩沖溶液中放4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0054]實施例3
[0055]能聯(lián)合免疫細(xì)胞增強腫瘤靶向殺傷能力的雙特性抗體，其制備方法如下:
[0056](I) PCL納米顆粒的制備:利用丙酮將PCL完全溶解至濃度為30mg/mL，按照丙酮和去離子水1:4的體積比，在1500rpm/min磁力攪拌的狀態(tài)下將PCL與丙酮的溶液加入去離子水中，形成均勻的乳濁液，然后繼續(xù)攪拌至丙酮揮發(fā)；
[0057](2) PCL納米顆粒的收集:15000rpm/min離心收集制備的納米顆粒，然后用去離子水重懸，重復(fù)操作2次洗滌納米顆粒；
[0058](3)PCL納米顆粒的活化:利用10mg/mL的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺混合溶劑室溫活化PLGA納米顆粒5h ;
[0059](4)PCL納米顆粒連接抗體:將活化后的納米材料離心收集，然后用0.1Μ、ρΗ = 8.0的杜氏磷酸鹽緩沖溶液洗滌納米材料一次，將需要連接的CD3和CD20單抗等量混合加入到連接反應(yīng)液，然后用含有所述第一抗體部分和第二抗體部分的連接反應(yīng)液重懸納米材料，室溫連接反應(yīng)2.5h，反應(yīng)結(jié)束后離心收集納米材料，用杜氏磷酸鹽緩沖溶液洗滌納米材料2次，然后再重懸到杜氏磷酸鹽緩沖溶液中放4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0060]實施例4
[0061]將實施例1的雙特異性抗體加入T細(xì)胞和癌細(xì)胞MCF-7殺傷實驗體系中，檢測該雙特異性抗體對T細(xì)胞殺傷癌細(xì)胞能力的提升情況，其中T細(xì)胞:MCF-7 = 4:1，反應(yīng)時間為8h，其中對照組為加等量納米顆粒(未連接任何抗體)，結(jié)果采用3次獨立重復(fù)實驗結(jié)果平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示，其評估結(jié)果如圖2所示，其中，*代表T檢驗比較具有顯著差異。
[0062]其中，圖2中的A表示較大顆粒(即采用轉(zhuǎn)速為8000rpm/min，1min離心收集得到的顆粒)的納米顆粒連接的雙特異性抗體，其中的B表示較小顆粒(即采用轉(zhuǎn)速為8000rpm/min, 1min未離心下來，15000rpm/min, 1min離心得到的顆粒)的納米顆粒連接的雙特異性抗體。
[0063]從圖2可以看出，其中對照組的殺傷率為7.9% ;較大顆粒的納米顆粒連接的雙特異性抗體組的殺傷率為24.5% ;較小顆粒的納米顆粒連接的雙特異性抗體的殺傷率為40.7% ο
[0064]通過上述實施例可以看出，本發(fā)明的雙特異性抗體對T細(xì)胞殺傷癌細(xì)胞的能力有所提升，能聯(lián)合免疫細(xì)胞增強腫瘤殺傷能力，相比CAR-T免疫細(xì)胞療法，具有副作用小，安全性高，成本低，使用方便等特點。
[0065]申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的工藝方法，但本發(fā)明并不局限于上述工藝步驟，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述工藝步驟才能實施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種能聯(lián)合免疫細(xì)胞增強腫瘤靶向殺傷能力的雙特異性抗體，其特征在于，其包括結(jié)合在效應(yīng)T細(xì)胞上表達(dá)的抗原的第一抗體部分和結(jié)合在靶細(xì)胞上表達(dá)的抗原的第二抗體部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙特異性抗體，其特征在于，所述第一抗體部分和第二抗體部分通過納米材料進(jìn)行連接； 優(yōu)選地，所述納米材料為生物可降解納米材料； 優(yōu)選地，所述納米材料為聚乳酸-羥基乙酸、聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚丁二醇丁二酸酯、聚苯胺、聚碳酸酯、乙丙交酯共聚物或乙交酯己內(nèi)酯共聚物中的任意一種或至少兩種的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙特異性抗體，其特征在于，所述靶細(xì)胞是B細(xì)胞、癌細(xì)胞或病原體細(xì)胞； 優(yōu)選地，所述靶細(xì)胞上表達(dá)的抗原為0)19、0)20、0)22、0)30、0)33、0)123、]\111(31、]\111(316、HER2、HER3、EGFRv II1、VEGFA、CEA、GPA33、GP10、ANG2、LI CAM、ROR-1、CS 1、MI CA 或 MICB 中的任意一種； 優(yōu)選地，所述效應(yīng)T細(xì)胞上表達(dá)的抗原為⑶2、⑶3、⑶4、⑶5、⑶6、⑶8、⑶25、⑶28、CD30、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD69 或 CD90 中的任意一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的雙特異性抗體的制備方法，其特征在于，其包括將納米材料與第一抗體部分和第二抗體部分連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，其包括以下步驟: (1)納米材料的制備、收集和活化； (2)將步驟(I)得到的納米材料與第一抗體部分和第二抗體部分的混合物進(jìn)行連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，所述納米材料的制備包括:利用溶劑將納米材料完全溶解，攪拌，加水，形成均勻的乳濁液； 優(yōu)選地，所述納米材料為聚乳酸-羥基乙酸、聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚丁二醇丁二酸酯、聚苯胺、聚碳酸酯、乙丙交酯共聚物或乙交酯己內(nèi)酯共聚物中的任意一種或至少兩種的混合物； 優(yōu)選地，所述溶劑為丙酮、丁酮、甲醇、乙醇或異丙醇中的任意一種或至少兩種的混合物； 優(yōu)選地，所述納米材料的收集包括:離心收集制備的納米材料，然后用去離子水重懸，重復(fù)操作2次洗滌納米材料； 優(yōu)選地，所述納米材料的活化包括:利用I?10mg/mL的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺混合溶劑室溫活化納米材料0.5?5h。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述連接包括:將活化后的納米材料離心收集，然后用連接反應(yīng)液洗滌納米材料I次，將需要連接的第一抗體部分和第二抗體部分等量混合加入到連接反應(yīng)液，然后用含有所述第一抗體部分和第二抗體部分的連接反應(yīng)液重懸納米材料，室溫連接反應(yīng)0.5?5h，反應(yīng)結(jié)束后離心收集納米材料，用杜氏磷酸鹽緩沖溶液洗滌納米材料2次，然后再重懸到杜氏磷酸鹽緩沖溶液中放4°C保存?zhèn)溆谩?br>8.根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項所述的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)納米材料的制備:利用丙酮將納米材料完全溶解至濃度為5?30mg/mL，按照丙酮和去離子水1:4的體積比，在500?1500rpm/min磁力攪拌的狀態(tài)下將納米材料與丙酮的溶液加入去離子水中，形成均勻的乳濁液，然后繼續(xù)攪拌至丙酮揮發(fā)； (2)納米材料的收集:8000?15000rpm/min離心收集制備的納米材料，然后用去離子水重懸，重復(fù)操作2次洗滌納米材料； (3)納米材料的活化:利用I?10mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺混合溶劑室溫活化納米材料0.5?5h ; (4)納米材料連接抗體:將活化后的納米材料離心收集，然后用0.1Μ、ρΗ = 8.0的杜氏磷酸鹽緩沖溶液洗滌納米材料I次，將需要連接的第一抗體部分和第二抗體部分等量混合加入到連接反應(yīng)液，然后用含有所述第一抗體部分和第二抗體部分的連接反應(yīng)液重懸納米材料，室溫連接反應(yīng)0.5?5h，反應(yīng)結(jié)束后離心收集納米材料，用杜氏磷酸鹽緩沖溶液洗滌納米材料2次，然后再重懸到杜氏磷酸鹽緩沖溶液中放4°C保存?zhèn)溆谩?br>9.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的雙特異性抗體在制備治療、預(yù)防或診斷腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種能聯(lián)合免疫細(xì)胞增強腫瘤靶向殺傷能力的雙特異性抗體及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明通過采用化學(xué)方法連接抗體和可降解的納米顆粒，使一個納米顆粒上同時連接兩種或兩種以上多個抗體分子，其中一種抗體能夠特異結(jié)合免疫細(xì)胞，另一種或幾種抗體可以特異結(jié)合腫瘤細(xì)胞，從而起到增強免疫細(xì)胞靶向特異殺傷腫瘤細(xì)胞的效果。相比CAR-T免疫細(xì)胞療法，采用本發(fā)明的雙特異性抗體具有生物可降解，無基因重組，副作用小，安全性高，成本低，可針對不同腫瘤細(xì)胞組合對應(yīng)的特異性抗體，使用方便等特點。
【IPC分類】A61P35-00, A61K39-44, C07K16-46, A61K47-48, C07K16-30
【公開號】CN104829730
【申請?zhí)枴緾N201510175130
【發(fā)明人】于浩洋, 李正成, 蘇靜
【申請人】蘇靜
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年4月14日