一種絲孢真菌培養(yǎng)物干制標(biāo)本的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種絲孢真菌培養(yǎng)物干制標(biāo)本的制作技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]長(zhǎng)期以來(lái)，絲孢真菌的分類鑒定主要以菌體形態(tài)特點(diǎn)為主，分生孢子的特征(形態(tài)、大小、隔膜數(shù)量、表面紋飾及附屬物等)是絲孢真菌主要的種級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)，分生孢子連續(xù)產(chǎn)生的外觀形態(tài)(產(chǎn)孢表型)亦是絲孢真菌種類鑒定的重要依據(jù)。而培養(yǎng)物干制標(biāo)本是絲孢真菌進(jìn)行長(zhǎng)期保存的重要方式之一。
[0003]絲孢真菌在人工培養(yǎng)過(guò)程中，易出現(xiàn)不產(chǎn)生分生孢子或難產(chǎn)生分生孢子的現(xiàn)象。目前促進(jìn)絲孢真菌產(chǎn)孢的主要方法有菌落劃傷法、紫外光照射法、冷凍刺激法、黑暗/光照交替培養(yǎng)法等，但這些方法均存在以下幾個(gè)缺點(diǎn):(I)促進(jìn)產(chǎn)孢的效果不明顯，產(chǎn)孢量少，產(chǎn)孢表型難于觀察；(2)難以準(zhǔn)確掌握處理時(shí)間，處理時(shí)間不當(dāng)會(huì)抑制絲孢真菌產(chǎn)孢或致死；(3)培養(yǎng)周期長(zhǎng)，往往經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)才會(huì)產(chǎn)孢；(4)產(chǎn)生的分生孢子特征不穩(wěn)定，不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的分生孢子特征存在較大差異。
[0004]培養(yǎng)物干制標(biāo)本在制作時(shí)，要求標(biāo)本能夠充分展示絲孢真菌典型的形態(tài)特點(diǎn)，包括菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子等。高品質(zhì)的絲孢真菌培養(yǎng)物干制標(biāo)本對(duì)于真菌學(xué)家開(kāi)展系統(tǒng)的絲孢真菌分類學(xué)研宄，特別是對(duì)已發(fā)現(xiàn)的絲孢真菌新物種鑒定具有重要意義。
[0005]目前，絲孢真菌培養(yǎng)物干制標(biāo)本制作的傳統(tǒng)步驟如下:首先根據(jù)絲孢真菌特性選擇合適的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；然后從培養(yǎng)皿中挖取絲孢真菌菌落置于水瓊脂培養(yǎng)平板上，在甲醛熏蒸桶中熏蒸處理；熏蒸結(jié)束后，取出帶有絲孢真菌菌落的培養(yǎng)平板，于通風(fēng)背光處自然晾干。但此方法存在以下幾個(gè)缺點(diǎn):(I)不同種類的絲孢真菌生長(zhǎng)特性差異較大，所需培養(yǎng)基類型也不同，很難準(zhǔn)確掌握絲孢真菌的培養(yǎng)時(shí)間，難于獲得具有典型形態(tài)特點(diǎn)的培養(yǎng)物，導(dǎo)致制作的干制標(biāo)本質(zhì)量不高；(2)標(biāo)本制作過(guò)程中，除了進(jìn)行絲孢真菌培養(yǎng)外，仍需配制水瓊脂培養(yǎng)基、滅菌、制備培養(yǎng)平板、挖取真菌菌落等操作，制作步驟繁瑣；(3)用于絲孢真菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基及水瓊脂培養(yǎng)平板均含有大量水分，導(dǎo)致標(biāo)本需要很長(zhǎng)時(shí)間才能充分晾干，天氣良好時(shí)充分晾干需要15?20天，天氣不好時(shí)晾干時(shí)間更長(zhǎng)并且標(biāo)本容易變臭，失去保存價(jià)值。
[0006]因此，急切需要尋求一種新的快速、簡(jiǎn)便的絲孢真菌培養(yǎng)物干制標(biāo)本制作方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是:針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種方法簡(jiǎn)單、步驟簡(jiǎn)便、能得到形態(tài)特征典型的絲孢真菌培養(yǎng)物的絲孢真菌培養(yǎng)物干制標(biāo)本的制作方法，更有利于真菌學(xué)家開(kāi)展系統(tǒng)的絲孢真菌分類學(xué)研宄和絲孢真菌新物種鑒定。
[0008]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0009]一種絲孢真菌培養(yǎng)物干制標(biāo)本的制作方法，包括以下步驟:
[0010]將配制好的瓊膠培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)皿中，待瓊膠培養(yǎng)基凝固后制成瓊膠培養(yǎng)平板，將剪了多個(gè)濾紙孔的濕濾紙平鋪在所述瓊膠培養(yǎng)平板表面上，然后在多個(gè)濾紙孔中心接種絲孢真菌菌種，密封后于室溫、自然光線下培養(yǎng)得到所述絲孢真菌培養(yǎng)物；所述瓊膠培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿和濾紙接種前均經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌。
[0011]取出瓊膠培養(yǎng)平板表面的濾紙放置于另一個(gè)培養(yǎng)皿中，于甲醛熏蒸桶中熏蒸6?8天，熏蒸結(jié)束后將濾紙?jiān)谕L(fēng)處自然晾干，即制作成絲孢真菌培養(yǎng)物干制標(biāo)本。
[0012]作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，所述瓊膠培養(yǎng)基的制備方法為:在100ml水中加入10?20g瓊脂粉、5?1g葡萄糖、5?1g淀粉、3?5g羧甲基纖維素鈉、5?1g蛋白胨、2?5g硫酸鎂、2?5g磷酸二氫鉀、2?5g硫酸亞鐵和50?80mg維生素B1，攪拌均勾。
[0013]作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述絲孢真菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)方法具體包括以下步驟:
[0014](I)取圓形濾紙，在所述濾紙上均勻剪出4個(gè)以上的濾紙孔，平放于培養(yǎng)皿中，加適量蒸餾水將所述濾紙浸濕，進(jìn)行高溫高壓滅菌后，取出濾紙。
[0015](2)配制瓊膠培養(yǎng)基，將配制好的瓊膠培養(yǎng)基滅菌，然后加入到滅菌后的培養(yǎng)皿中，每培養(yǎng)皿加入量為15?20ml，待瓊膠培養(yǎng)基凝固后制成瓊膠培養(yǎng)平板。
[0016](3)用無(wú)菌鑷子將所述經(jīng)過(guò)滅菌的濾紙平鋪在瓊膠培養(yǎng)平板表面上，使所述濾紙與所述瓊膠培養(yǎng)平板之間無(wú)空隙，無(wú)氣泡。
[0017](4)然后用無(wú)菌針挑取適量絲孢真菌菌種，接種于所述濾紙上的各個(gè)濾紙孔中心位置的改良瓊膠培養(yǎng)平板上。
[0018](5)蓋上培養(yǎng)皿蓋，用封口膜密封，然后于室溫、自然光線下培養(yǎng)10?30天，濾紙表面形成典型的絲孢真菌菌落(包括大量菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及分生孢子)，即得到所述絲孢真菌培養(yǎng)物。
[0019]上述各步驟均在超凈工作臺(tái)中完成。
[0020]作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟(I)中，在所述濾紙上均勻剪出4?6個(gè)濾紙孔。
[0021]作為進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述濾紙直徑為65?75mm，所述濾紙孔的直徑為12 ?18mm0
[0022]作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟(4)中，所述絲孢真菌菌種的接種量為每孔接種直徑2?5_菌餅。
[0023]作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述的高溫高壓滅菌是在溫度121°C、壓力120kPa條件下保持滅菌20分鐘。
[0024]由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是:
[0025]本發(fā)明方法在絲孢真菌培養(yǎng)時(shí)在一個(gè)培養(yǎng)皿中多位點(diǎn)接種，實(shí)現(xiàn)菌落多發(fā)，分生孢子在濾紙上分布均勻，相比傳統(tǒng)的每皿只接種一個(gè)位點(diǎn)、接種多皿的操作方法，大大減少工作量，并且在產(chǎn)生分生孢子后，同時(shí)進(jìn)行絲孢真菌不同時(shí)期產(chǎn)孢表型的連續(xù)觀察，避免多次重復(fù)培養(yǎng)，節(jié)省時(shí)間，節(jié)約成本；在絲孢真菌培養(yǎng)結(jié)束后，只需取出表層濾紙進(jìn)行熏蒸、晾干即可完成標(biāo)本制作，不需要配制水瓊脂培養(yǎng)基、滅菌、平板制作及挖取真菌菌落等繁瑣操作，整個(gè)制作過(guò)程相比現(xiàn)有技術(shù)更加簡(jiǎn)便，而且經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后濾紙表面長(zhǎng)有大量絲孢真菌菌落(包括菌絲、典型產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及分生孢子)，并且濾紙的含水量極少，在通風(fēng)處僅需1-2小時(shí)就可完全干燥，相對(duì)于傳統(tǒng)方法，極大的縮短了標(biāo)本干燥時(shí)間，提高了標(biāo)本制作效率和質(zhì)量。
[0026]本發(fā)明瓊膠培養(yǎng)基的制備方法為:在100ml水中加入10?20g瓊脂粉、5?1g葡萄糖、5?1g淀粉、3?5g羧甲基纖維素鈉、5?1g蛋白胨、2?5g硫酸鎂、2?5g磷酸二氫鉀、2?5g硫酸亞鐵和50?80mg維生素B1，攪拌均勻得到，本發(fā)明使用的改良瓊膠培養(yǎng)基含有的營(yíng)養(yǎng)成分及微量元素，滿足了絲孢真菌前期菌絲生長(zhǎng)及后期孢子產(chǎn)生所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并在室溫、自然光線下培養(yǎng)，接近絲孢真菌在自然環(huán)境中的生長(zhǎng)條件(自然光照、溫度、寡營(yíng)養(yǎng))，誘導(dǎo)產(chǎn)生的分生孢子特征穩(wěn)定，能夠充分表現(xiàn)出自身的種級(jí)特征。
[0027]本發(fā)明絲孢真菌培養(yǎng)方法操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)條件溫和，無(wú)需特殊設(shè)備，一般微生物實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行，所用改良瓊膠培養(yǎng)基可培養(yǎng)誘導(dǎo)絕大多數(shù)絲孢真菌產(chǎn)孢，不需要根據(jù)絲孢真菌種類選擇培養(yǎng)基類型，且誘導(dǎo)絲孢真菌產(chǎn)孢效果顯著，對(duì)多數(shù)絲孢真菌有效，分生孢子在濾紙上分布均勻，不僅便于觀察培養(yǎng)過(guò)程的產(chǎn)孢表型，而且制作的干制標(biāo)本能夠充分展示絲孢真菌典型的形態(tài)特點(diǎn)，便于其他真菌工作者的后續(xù)研宄。
【附圖說(shuō)明】
[0028]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
[0029]圖1是用于絲孢真菌培養(yǎng)的瓊膠培養(yǎng)平板；
[0030]圖2是絲孢真菌菌株(菌株編號(hào)為YC1407)在本發(fā)明的瓊膠培養(yǎng)基上不同培養(yǎng)時(shí)間的菌落形態(tài)；
[0031]圖3是絲孢真菌菌株(菌株編號(hào)為YC1407)在本發(fā)明的瓊膠培養(yǎng)基上不同培養(yǎng)時(shí)間的產(chǎn)孢形態(tài)；
[0032]圖4是絲孢真菌菌株(菌株編號(hào)為YC1407)在本發(fā)明的瓊膠培養(yǎng)基上不同培養(yǎng)時(shí)間的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子；
[0033]圖5是絲孢真菌菌株(菌株編號(hào)為YC1407)在PDA培養(yǎng)基上不同培養(yǎng)時(shí)間的菌落形態(tài)；
[0034]圖6是絲孢真菌菌株(菌株編號(hào)為YC1407)在PDA培養(yǎng)基上不同培養(yǎng)時(shí)間的產(chǎn)孢形態(tài)；
[0035]圖7是絲孢真菌在本發(fā)明瓊膠培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；
[0036]圖8是本發(fā)明制作的絲孢真菌培養(yǎng)物干制標(biāo)本。
[0037]圖9是對(duì)比例2中利用現(xiàn)有技術(shù)制作的絲孢真菌培養(yǎng)物干制標(biāo)本。
【具體實(shí)施方式】
[0038]下面結(jié)合附圖和具體的實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0039]實(shí)施例1
[0040]取圓形濾紙，在所述濾紙上均勻剪出4個(gè)濾紙孔，平放于培養(yǎng)皿中，加適量蒸餾水將所述濾紙浸濕，在溫度121°C、壓力120kPa條件下保持滅菌20分鐘后，取出濾紙。
[0041]配制瓊膠培養(yǎng)基，將配制好的瓊膠培養(yǎng)基在溫度121°C、壓力120kPa條件下滅菌，然后加入到滅菌后的培養(yǎng)皿中，待瓊膠培養(yǎng)基凝固后制成瓊膠培養(yǎng)平板。
[0042]用無(wú)菌鑷子將所述經(jīng)過(guò)滅菌的濾紙平鋪在瓊膠培養(yǎng)平板表面上，使所述濾紙與所述瓊膠培養(yǎng)平板之間無(wú)空隙，無(wú)氣泡。
[0043]然后用無(wú)菌針挑取適量絲孢真菌菌種，接種于所述濾紙上的各個(gè)濾紙孔中心位置的改良瓊膠培養(yǎng)平板上。
[0044]蓋上培養(yǎng)皿蓋密封，然后于室溫、自然光線下培養(yǎng)，第10天開(kāi)始濾紙表面產(chǎn)生分生孢子，培養(yǎng)10?30天，濾紙表面形成典型的絲孢真菌培養(yǎng)物(包括大量菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及分生孢子)。
[0045]取出瓊膠培養(yǎng)平板表面的濾紙放置于另一個(gè)