一種海洋光合細(xì)菌規(guī)?；a(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種細(xì)菌的培養(yǎng)方法，特別涉及一種海洋光合細(xì)菌的高效大規(guī)模生產(chǎn) 方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 光合細(xì)菌（photosyntheticbacteria，簡(jiǎn)稱PSB)通常是指一大類能夠在有光照 缺氧的環(huán)境中能進(jìn)行不放氧的光合作用的一群微生物，光合細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)只有一個(gè)光系統(tǒng)即 PSI，區(qū)別于綠色植物的是，它們的光合作用是不產(chǎn)氧的。光合細(xì)菌光合作用的原始供氫體 不是水，而是一些有機(jī)物，其光合作用的結(jié)果是可以分解有機(jī)物，光合細(xì)菌獨(dú)特的生理特性 使它們?cè)谏鷳B(tài)系統(tǒng)中的地位顯得極為重要。尤其在水環(huán)境污水處理和水產(chǎn)養(yǎng)殖中由于其具 有較強(qiáng)凈化污水功能而廣泛被使用水質(zhì)凈化以及水環(huán)境生態(tài)改良劑。
[0003] 另外光合細(xì)菌還具有非常重要營(yíng)養(yǎng)及保健功能，光合細(xì)菌是營(yíng)養(yǎng)成份很豐富的菌 類之一，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)65%，氨基酸組成豐富；光合細(xì)菌還含有豐富的維生素，特別是 人和動(dòng)物幼體發(fā)育所必需的B族維生素類，如B12、葉酸等，光合細(xì)菌菌體生物素的含量很 高，是啤酒酵母和小球藻的20至60多倍。此外還含有多種微量元素、促生長(zhǎng)因子、促免疫 因子和輔酶Q、5_氨基乙酰丙酸（5-ALA)、卟啉、核糖核酸（RNA)和類胡蘿卜素等重要生理活 性物質(zhì)。國(guó)外的一些保健品的品種中都有加不同比重的光合細(xì)菌菌液。
[0004] 由于這些特點(diǎn)，近年來(lái)在有機(jī)污水處理，水產(chǎn)養(yǎng)殖，生物菌肥，農(nóng)業(yè)種植，食品，醫(yī) 療和保健等領(lǐng)域掀起了使用光合細(xì)菌的熱潮。
[0005] 相對(duì)于光合細(xì)菌的巨大需求，我國(guó)在光合細(xì)菌的生產(chǎn)技術(shù)上、規(guī)模化生產(chǎn)等方面 目前還非常不成熟。尤其在海洋光合細(xì)菌的規(guī)?；a(chǎn)方面技術(shù)不成熟，其中主要表現(xiàn)在 以下幾個(gè)方面： 1、光合細(xì)菌的常規(guī)培養(yǎng)方法依賴于光照，而大規(guī)模生產(chǎn)受限于昂貴的光反應(yīng)器的投資 成本，國(guó)內(nèi)多目前多采用粗放光靜止培養(yǎng)方法，利用透明玻璃瓶、塑料瓶、玻璃缸、塑料袋或 塑料桶等容器進(jìn)行光照靜置小體積培養(yǎng)，在大體積培養(yǎng)方面偶爾用槽式，池子等半開(kāi)放或 開(kāi)放式培養(yǎng)，但這些培養(yǎng)方式進(jìn)行光合細(xì)菌生產(chǎn)的存在規(guī)模小，或者培養(yǎng)效率低，菌體濃度 和純度低，易遭雜菌污染。
[0006] 2、由于目前海洋光合細(xì)菌生產(chǎn)多采用光照靜置培養(yǎng)，光合細(xì)菌是進(jìn)行光自養(yǎng)或光 異養(yǎng)生長(zhǎng)，細(xì)菌的倍增時(shí)間長(zhǎng)，造成生產(chǎn)周期長(zhǎng)，通常需要7-20天。尤其是在規(guī)?；a(chǎn) 中，當(dāng)從少量的菌種擴(kuò)大生產(chǎn)到幾十立方的規(guī)模，常規(guī)的光靜置培養(yǎng)需要很長(zhǎng)的時(shí)間，生產(chǎn) 周期長(zhǎng)，降低了設(shè)備利用率，增加了生產(chǎn)成本。
[0007] 3、目前海洋光合細(xì)菌的規(guī)模化生產(chǎn)通常使用半開(kāi)放和開(kāi)放式的生產(chǎn)方式，培養(yǎng)基 易染菌，光合細(xì)菌的得率低，菌體濃度通常低于1〇 7cfu/ml，并且開(kāi)放生產(chǎn)中雜菌率非常高， 影響廣品品質(zhì)。
[0008] 4、目前海水光合細(xì)菌的培養(yǎng)基中沿襲淡水光合細(xì)菌培養(yǎng)方式，過(guò)度使用磷酸鹽， 容易與海水中的鈣鎂離子形成沉淀，一方面造成試劑浪費(fèi)，并且會(huì)影響培養(yǎng)基的透明度，干 擾生長(zhǎng)過(guò)程對(duì)菌體生長(zhǎng)密度的檢測(cè)，同時(shí)渾濁的培養(yǎng)基還會(huì)減少有效光照強(qiáng)度。
[0009] 由于上述這些問(wèn)題的存在，極大限制了我國(guó)海洋光合細(xì)菌的規(guī)?；a(chǎn)及其應(yīng) 用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 針對(duì)海洋光合細(xì)菌規(guī)?；a(chǎn)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)效率 高，生產(chǎn)成本低的海洋光合細(xì)菌規(guī)模化生產(chǎn)方法，以促進(jìn)海洋光合細(xì)菌產(chǎn)品在水產(chǎn)、食品、 醫(yī)藥和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明根據(jù)光合細(xì)菌自身的代謝特點(diǎn)：即能夠在需氧不需光的條件下快速異養(yǎng)生 長(zhǎng)來(lái)增加細(xì)胞數(shù)量，又能夠在光厭氧的條件下高效率利用低分子的有機(jī)物進(jìn)行生長(zhǎng)，以及 合成一些生物活性物質(zhì)的特點(diǎn)，通過(guò)設(shè)計(jì)需氧不需光的暗反應(yīng)與光厭氧發(fā)酵兩階段相耦合 的生產(chǎn)工藝，并根據(jù)光合細(xì)菌在需氧異養(yǎng)條件下可快速生長(zhǎng)的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了適合該階段的 營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，促進(jìn)光合細(xì)菌迅速生長(zhǎng)，快速增加細(xì)胞的數(shù)量，此階段生產(chǎn)裝置只需要 一般好氧發(fā)酵的發(fā)酵罐，不需要昂貴的光反應(yīng)發(fā)酵罐；而第二階段通過(guò)在厭氧光合管道中 利用不會(huì)產(chǎn)生沉淀的，低營(yíng)養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行光厭氧發(fā)酵，這個(gè)階段的生產(chǎn)規(guī)?？伸`活的 通過(guò)增減光合管道來(lái)設(shè)置，并且還可以通過(guò)在光厭氧發(fā)酵中應(yīng)用不同補(bǔ)料方式實(shí)現(xiàn)分批發(fā) 酵，間歇補(bǔ)料，和連續(xù)補(bǔ)料等方式生產(chǎn)，具有投資少，高度靈活性，可根據(jù)具體的情況采用不 同生產(chǎn)方式和不同生產(chǎn)規(guī)模的特點(diǎn)。
[0012] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：一種海洋光合細(xì)菌規(guī)模化生產(chǎn)方法，包括需氧不需 光發(fā)酵過(guò)程和光厭氧發(fā)酵過(guò)程兩個(gè)階段；首先在需氧不需光的發(fā)酵過(guò)程中，海洋光合細(xì)菌 菌種與需氧不需光發(fā)酵階段培養(yǎng)基按1:(5-20)的體積比混合后置于需氧不需光的普通 微生物發(fā)酵罐中發(fā)酵，需氧不需光發(fā)酵階段培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分及質(zhì)量百分比為：乙酸鈉： 0? 15-0. 5%、酵母粉：0? 0001-0. 5%、蛋白胨：0? 001-0. 5%、氯化銨：0? 01-0. 2%、糖（葡萄糖或 蔗糖、麥芽糖等其他常用碳源）：〇. 0001-2%、H2P04-:0 . 001-1%、Fe3+:0. 00001-0. 01% ;培養(yǎng)基 其余成分為無(wú)污染的海水或者人工海水，培養(yǎng)基通過(guò)1-5 M的乙酸和1-5 M氫氧化鈉調(diào)節(jié) 酸堿度，最終的培養(yǎng)基的pH介于6. 0-7. 5之間，培養(yǎng)基經(jīng)115-121°C高溫滅菌后使用。此 階段發(fā)酵容器可以是試管、三角燒瓶或發(fā)酵罐，并且對(duì)光照沒(méi)有要求，有光無(wú)光都可發(fā)酵， 發(fā)酵容器或設(shè)備要求要求能夠高壓115-121°C滅菌，抗海水腐蝕，發(fā)酵過(guò)程中要求溫度可 控和無(wú)菌通氣供氧。在此階段光合細(xì)菌發(fā)酵過(guò)程中光合細(xì)菌種子液按照比例加入培養(yǎng)基 后好氧發(fā)酵，發(fā)酵期間溫度控制在20-40°C，發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵液的溶氧分壓為50%-100%飽和 溶氧分壓。發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程pH控制在6.3-8. 0之間；需氧不需光的發(fā)酵階段的發(fā)酵時(shí)間 為24-48小時(shí)，當(dāng)發(fā)酵罐中的光合細(xì)菌濃度達(dá)到波長(zhǎng)660nm下光密度值（即0D66Q)大于0. 8 時(shí)可以停止發(fā)酵，并將發(fā)酵罐中的發(fā)酵液按照1 :(3-15)的體積比用滅菌的管道輸送到 第二階段進(jìn)行光厭氧發(fā)酵：此過(guò)程的培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分低于需氧不需光的過(guò)程的培養(yǎng)基，并 且不含葡萄糖，蔗糖或麥芽糖等碳源成分，光厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基成分及質(zhì)量百分比為：乙酸 鈉：0? 15-0. 5%、酵母粉：0? 0001-0. 1%、蛋白胨：0? 0001-0. 1%、氯化銨：0? 0001-0. 1%、H2P(V : 0. 0001-0. 01%、Fe3+: 0. 00001-0. 001%，培養(yǎng)基其余成分為無(wú)污染的海水或人工海水，培養(yǎng)基 酸堿度通過(guò)1-5M的乙酸或1-5M氫氧化鈉調(diào)節(jié)，最終pH應(yīng)介于與6.0-7. 5之間。培養(yǎng)基要 除菌消毒，除菌消毒的方法可以通過(guò)在密閉不銹鋼容器中煮沸30-60分鐘，或者經(jīng)高壓滅 菌設(shè)備110-121°C滅菌20-30分鐘，也可利用高氯酸或二氧化氯等含氯的消毒劑除菌，保 證除菌后的培養(yǎng)基中的雜菌應(yīng)低于3cfu/ml，并且殘留的游離氯應(yīng)低于0.06mg/L。光厭 氧發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵溫度為15-40 °C，可通過(guò)日光溫室，或者水浴進(jìn)行溫度調(diào)節(jié)，光源可利用 自然光照或者人工輔助光源，但應(yīng)避免太陽(yáng)光暴曬，每天保證8-24小時(shí)光照時(shí)間，光強(qiáng)度 應(yīng)介于1200Lux-8000Lux之間；通常使用日光燈等人工輔助光源能增加光照時(shí)間，進(jìn)而 加快光厭氧階段光合細(xì)菌的生長(zhǎng)速率，縮短發(fā)酵周期。海洋光合細(xì)菌光厭氧發(fā)酵階段在透 明的管道內(nèi)發(fā)酵，2-15天后當(dāng)菌體的濃度OD66(|大于1. 2時(shí)，并且繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間菌體的 濃度增加緩慢，即〇D_每天的增長(zhǎng)量小于0. 1時(shí)，終止發(fā)酵。
[0013] 發(fā)酵后的海洋光合細(xì)菌可直接灌裝或離心濃縮液體或通過(guò)其他載體吸附、干燥等 工藝包裝制成可用于食品、醫(yī)藥、水產(chǎn)、種植、養(yǎng)殖、環(huán)保等領(lǐng)域的光合細(xì)菌制劑。
[0014] 光厭氧發(fā)酵階段使用的透明管道可采用透明玻璃，透明有機(jī)玻璃，或其他 透明塑料如聚乙稀，聚丙稀，聚碳酸醋，聚氨醋（Polyurethane，PU)，熱塑性聚氨醋 (Thermoplastic Urethane，TPU)等材料，可以是透明的硬質(zhì)管道或軟管道，管道要求能夠 耐受大于〇. 15兆帕的靜水壓，管道的直徑介于90mm-600mm之間，并且能夠耐受3M的鹽酸 或5M的燒堿處理100小時(shí)以上。管道與管道直接可以通過(guò)不銹鋼法蘭或卡箍進(jìn)行連接。管 道的長(zhǎng)度可以根據(jù)生產(chǎn)需要和生產(chǎn)場(chǎng)地具體而定，一般單條管道長(zhǎng)幾米到上千米。該階段 可同時(shí)進(jìn)行多條管道的并聯(lián)發(fā)酵，擴(kuò)大發(fā)酵規(guī)模。管道之間可設(shè)置相應(yīng)口徑的不銹鋼的閥 門(mén)控制管道液體的流向和流量。還可以通過(guò)三通或閥門(mén)連接耐酸堿腐蝕的泵，用于管道消 毒或者管道清洗，培養(yǎng)基發(fā)酵液混合等。
[0015] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1、 設(shè)備投資少，不需要昂貴的光合反應(yīng)發(fā)酵罐，便于放大進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)； 2、 根據(jù)光合細(xì)菌生長(zhǎng)代謝特點(diǎn)設(shè)計(jì)了能夠滿足光合細(xì)菌快速增殖的需氧不需光-光 厭氧耦合發(fā)酵工藝； 3、 在需氧不需光的發(fā)酵階段的培養(yǎng)基中添加了葡萄糖等可發(fā)酵碳源，并且在光厭氧培 養(yǎng)基中提高的有機(jī)氮源如蛋白胨、酵母粉和無(wú)機(jī)氮源如氯化銨或硫酸銨的濃度，提高了光 合細(xì)菌好氧異養(yǎng)生長(zhǎng)繁殖速率高，可快速增加菌體的生物量，相對(duì)于常規(guī)的光照靜止培養(yǎng) 能大大縮短發(fā)酵時(shí)間2-8倍，并且活菌數(shù)提高2-10倍； 4、 本發(fā)明的光厭氧發(fā)酵階段使用透明管道，可通過(guò)調(diào)整管道的長(zhǎng)短控制生產(chǎn)規(guī)模，并 且光厭氧發(fā)酵階段也可單獨(dú)使用，并根據(jù)補(bǔ)充培養(yǎng)基的方式進(jìn)行分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵或流 加發(fā)酵，具有非常高的靈活性和可控程度；透明管道光厭氧發(fā)酵可利用自然光源或人工光 源提高了光合細(xì)菌的生長(zhǎng)率。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
[0017] 實(shí)施例1: 材料與方法