40mLPBS進(jìn)行重懸，2000rpm離心5min，棄上清。
[0066] 4、往六孔板中加入0. 1 %明膠，lmL/孔，常溫下孵育30min，結(jié)束后棄去明膠溶液。
[0067] 5、用lonza完全培養(yǎng)基重懸沉淀，調(diào)整細(xì)胞密度為IX105cell/mL，接種至孵育過 明膠的六孔板中，2mL/孔；轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。
[0068]6、培養(yǎng)13h后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至新的六孔板中（切勿吹打，貼壁的均為內(nèi)皮細(xì)胞）， 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。
[0069] 7、24h后觀察到貼壁的細(xì)胞多為間充質(zhì)干細(xì)胞，共培養(yǎng)72h。
[0070] 二、傳代培養(yǎng)：
[0071] 待原代細(xì)胞融合率達(dá)85 %時，用0.25 %胰酶-0.02%EDTA進(jìn)行酶解傳代。
[0072] 調(diào)整細(xì)胞密度為lX105cell/mL，接種8mL至9cm平皿中，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行 培養(yǎng)5h。
[0073]5h后，取出平皿，吸棄上清，加入新lonza完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0074] 繼續(xù)培養(yǎng)4h至細(xì)胞貼壁，棄除培養(yǎng)液，貼壁的細(xì)胞為進(jìn)一步純化的間充質(zhì)干細(xì) 胞。
[0075] 經(jīng)檢測，間充質(zhì)干細(xì)胞純度為99. 5%。
[0076] 實(shí)施例3
[0077] 本發(fā)明提供的羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的純化過程具體為：
[0078] -、原代培養(yǎng)：
[0079] 1、取剖腹產(chǎn)產(chǎn)婦的羊水，用無菌容器盛裝后，放入超凈臺中。
[0080] 2、把羊水分裝至50mL離心管中，2000rpm離心5min，棄上清。
[0081] 3、每個50mL離心管中加入40mLPBS進(jìn)行重懸，2000rpm離心5min，棄上清。
[0082] 4、往六孔板中加入0. 1 %明膠，lmL/孔，常溫下孵育30min，結(jié)束后棄去明膠溶液。
[0083] 5、用lonza完全培養(yǎng)基重懸沉淀，調(diào)整細(xì)胞密度為IX106cell/mL，接種至孵育過 明膠的六孔板中，2mL/孔；轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。
[0084] 6、培養(yǎng)llh后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至新的六孔板中（切勿吹打，貼壁的均為內(nèi)皮細(xì)胞）， 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。
[0085] 7、24h后觀察到貼壁的細(xì)胞多為間充質(zhì)干細(xì)胞，共培養(yǎng)72h。
[0086] 二、傳代培養(yǎng)：
[0087] 待原代細(xì)胞融合率達(dá)85 %時，用0.25 %胰酶-0.02%EDTA進(jìn)行酶解傳代。
[0088] 調(diào)整細(xì)胞密度為lX105cell/mL，接種8mL至9cm平皿中，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行 培養(yǎng)3h。
[0089] 3h后，取出平皿，吸棄上清，加入新lonza完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0090] 繼續(xù)培養(yǎng)4h至細(xì)胞貼壁，棄除培養(yǎng)液，貼壁的細(xì)胞為進(jìn)一步純化的間充質(zhì)干細(xì) 胞。
[0091] 經(jīng)檢測，間充質(zhì)干細(xì)胞純度為92. 5%。
[0092] 對比例1
[0093] 本發(fā)明提供的羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的純化過程具體為：
[0094] -、原代培養(yǎng)：
[0095] 1、取剖腹產(chǎn)產(chǎn)婦的羊水，用無菌容器盛裝后，放入超凈臺中。
[0096] 2、把羊水分裝至50mL離心管中，2000rpm離心5min，棄上清。
[0097] 3、每個50mL離心管中加入40mLPBS進(jìn)行重懸，2000rpm離心5min，棄上清。
[0098] 4、往六孔板中加入0. 1 %明膠，lmL/孔，常溫下孵育30min，結(jié)束后棄去明膠溶液。
[0099] 5、用F12/DMEM+10%FBS培養(yǎng)基重懸沉淀，調(diào)整細(xì)胞密度為5X105cell/mL，接種 至孵育過明膠的六孔板中，2mL/孔；轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。
[0100] 6、培養(yǎng)12h后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至新的六孔板中（切勿吹打，貼壁的均為內(nèi)皮細(xì)胞）， 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。
[0101] 7、24h后觀察到貼壁的細(xì)胞多為間充質(zhì)干細(xì)胞，共培養(yǎng)72h。
[0102] 二、傳代培養(yǎng)：
[0103] 待原代細(xì)胞融合率達(dá)85 %時，用0. 25 %胰酶-0. 02%EDTA進(jìn)行酶解傳代。
[0104] 調(diào)整細(xì)胞密度為lX105cell/mL，接種8mL至9cm平皿中，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行 培養(yǎng)4h。
[0105] 4h后，取出平皿，吸棄上清，加入新F12/DMEM+10%FBS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0106] 繼續(xù)培養(yǎng)4h至細(xì)胞貼壁，棄除培養(yǎng)液，貼壁的細(xì)胞為進(jìn)一步純化的間充質(zhì)干細(xì) 胞。
[0107] 經(jīng)檢測，間充質(zhì)干細(xì)胞純度為85. 6%。
[0108] 對比例2
[0109] 本發(fā)明提供的羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的純化過程具體為：
[0110] 一、原代培養(yǎng)：
[0111] 1、取剖腹產(chǎn)產(chǎn)婦的羊水，用無菌容器盛裝后，放入超凈臺中。
[0112] 2、把羊水分裝至50mL離心管中，2000rpm離心5min，棄上清。
[0113] 3、每個50mL離心管中加入40mLPBS進(jìn)行重懸，2000rpm離心5min，棄上清。
[0114] 4、往六孔板中加入0. 1%明膠，lmL/孔，常溫下孵育30min，結(jié)束后棄去明膠溶液。
[0115] 5、用DMEM高糖+10%FBS培養(yǎng)基重懸沉淀，調(diào)整細(xì)胞密度為5X105cell/mL，接種 至孵育過明膠的六孔板中，2mL/孔；轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。
[0116] 6、培養(yǎng)12h后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至新的六孔板中（切勿吹打，貼壁的均為內(nèi)皮細(xì)胞）， 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。
[0117] 7、24h后觀察到貼壁的細(xì)胞多為間充質(zhì)干細(xì)胞，共培養(yǎng)72h。
[0118] 二、傳代培養(yǎng)：
[0119] 待原代細(xì)胞融合率達(dá)85 %時，用0. 25 %胰酶-0. 02%EDTA進(jìn)行酶解傳代。
[0120] 調(diào)整細(xì)胞密度為lX105cell/mL，接種8mL至9cm平皿中，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行 培養(yǎng)4h。
[0121] 4h后，取出平皿，吸棄上清，加入新DMEM高糖+10%FBS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0122] 繼續(xù)培養(yǎng)4h至細(xì)胞貼壁，棄除培養(yǎng)液，貼壁的細(xì)胞為進(jìn)一步純化的間充質(zhì)干細(xì) 胞。
[0123] 經(jīng)檢測，間充質(zhì)干細(xì)胞純度為93. 5%。
[0124] 實(shí)施例4
[0125] 觀測實(shí)施例1~3和對比例1~2的細(xì)胞生長情況，并繪制細(xì)胞增殖曲線。其中， 對實(shí)施例1和對比例1~2細(xì)胞生長情況所繪制的曲線如圖2所示。結(jié)果表明，實(shí)施例1 培養(yǎng)細(xì)胞的增殖速度顯著優(yōu)于對比例1~2。（p〈0. 05)
[0126] 實(shí)施例5
[0127] 原代培養(yǎng)12h后，細(xì)胞到達(dá)對數(shù)期，取處于對數(shù)生長期的羊水干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密 度為lX106cell/mL。按細(xì)胞懸液：0.4%臺盼藍(lán)=3:l(v:v)充分混勻，取20uL細(xì)胞混勻液 加入細(xì)胞計數(shù)板中，用Countstar細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞活率及體積檢測。每組細(xì)胞檢測3 次。對實(shí)施例1~3及對比例1~2培養(yǎng)后的干細(xì)胞的活力如表1所示：
[0128] 表1干細(xì)胞活力
[0129]
【主權(quán)項】
1. 羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括： 步驟1 :明膠鋪板后接種羊水組織細(xì)胞，培養(yǎng)Ilh~13h后轉(zhuǎn)移培養(yǎng)液； 步驟2 :將所述培養(yǎng)液培養(yǎng)至細(xì)胞融合率不低于85%，獲得初步純化的細(xì)胞； 步驟3 :將所述初步純化的細(xì)胞重懸，培養(yǎng)3h~5h后，更新培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞貼 壁，棄除培養(yǎng)液，獲得羊水間充質(zhì)干細(xì)胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的原代分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟1中所述接種的羊水組 織細(xì)胞密度為5 X IO5個/mL。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的原代分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟1中所述培養(yǎng)的培養(yǎng)基 為Lonza完全培養(yǎng)基；步驟1中所述培養(yǎng)的溫度為37°C，5% CO2、濕度為95%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的原代分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟1中所述培養(yǎng)的時間為 12h〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的原代分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟2中所述培養(yǎng)的時間為 72h〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的原代分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟3中所述重懸至細(xì)胞密 度為IX IO5個/mL。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的原代分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟3所述重懸采用Lonza 完全培養(yǎng)基；步驟3中所述培養(yǎng)的溫度為37°C，5% CO2、濕度為95%。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的原代分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟3所述培養(yǎng)的時間為 4h，繼續(xù)培養(yǎng)的時間為120h。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的原代分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述羊水組織細(xì)胞的獲取 方法為：將羊水離心后取沉淀，以PBS緩沖液洗滌，獲得羊水組織細(xì)胞。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1~9任一項所述的原代分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述羊水組織 細(xì)胞為人羊水組織細(xì)胞。
【專利摘要】本發(fā)明涉及干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)方法。本發(fā)明提供的方法，利用差速貼壁原理，在適宜條件下，使內(nèi)皮細(xì)胞先貼壁生長，而此時間充質(zhì)干細(xì)胞尚未貼壁。本發(fā)明準(zhǔn)確控制培養(yǎng)時間，待內(nèi)皮細(xì)胞貼壁完成后，轉(zhuǎn)移包含羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液。對培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng)后獲得羊水間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明提供的方法操作簡單，無需更多的儀器，且無需人為刮除的操作，避免了細(xì)胞的損傷和污染。檢測結(jié)果表明，步驟1中獲得的培養(yǎng)液中所包含的羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的活力不低于89.28％，經(jīng)傳代3代，流式細(xì)胞檢測結(jié)果表明，其表面抗體仍符合干細(xì)胞特性，未見分化趨勢。
【IPC分類】C12N5-0775
【公開號】CN104830764
【申請?zhí)枴緾N201510289599
【發(fā)明人】葛嘯虎, 陳海佳, 王一飛, 盧瑞珊, 王小燕, 李平, 馬巖巖
【申請人】廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年5月29日