E6基因序列正確，發(fā)明人成功構(gòu)建獲得了 HPVE6抗原cDNA質(zhì)粒。
[0096] 2體外轉(zhuǎn)錄
[0097] 2. 1線性化處理
[0098] 取構(gòu)建好的HPVE6抗原cDNA質(zhì)粒，基于pcDNA3. 1載體建議的線性化酶切位點(diǎn) Bstll07I(距離終止密碼子比較遠(yuǎn)，2KB左右）進(jìn)行線性化處理。
[0099] 2. 2體外轉(zhuǎn)錄
[0100] 利用I7MessageMachine試劑盒（Ambion公司），將經(jīng)過線性化處理的HPVE6抗原 cDNA質(zhì)粒（即作為體外轉(zhuǎn)錄的DNA模板）進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，具體如下：
[0101] 首先，在一個(gè)RNase-free的塑料離心管中，在室溫下按次序加入下列成分，制備 反應(yīng)體系（20微升）：
[0102]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種制備DC細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟： 將單核細(xì)胞進(jìn)行第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，以便獲得未成熟的DC細(xì)胞； 利用HPVE6抗原mRNA轉(zhuǎn)染所述未成熟的DC細(xì)胞，以便獲得經(jīng)過轉(zhuǎn)染的未成熟DC細(xì)胞； 以及 將所述經(jīng)過轉(zhuǎn)染的未成熟DC細(xì)胞進(jìn)行第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，以便獲得成熟的DC細(xì)胞， 其中，所述單核細(xì)胞是從樣本的外周血單個(gè)核細(xì)胞中分離獲得的。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述HPVE6抗原mRNA是通過以下步驟獲 得的： 制備HPVE6抗原cDNA質(zhì)粒，所述HPVE6抗原cDNA的核酸序列如SEQ ID NO :1所示； 將所述HPVE6抗原cDNA質(zhì)粒進(jìn)行線性化處理，以便獲得經(jīng)過線性化處理的HPVE6抗原 cDNA質(zhì)粒；以及 將所述經(jīng)過線性化處理的HPVE6抗原cDNA質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，以便獲得HPVE6抗原 mRNA 〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，以pcDNA3. 1載體為骨架載體，制備所述 HPVE6抗原cDNA質(zhì)粒， 任選地，所述pcDNA3. 1載體具有BamhI、XbaI和Bstl 1071酶切位點(diǎn)， 任選地，基于酶切位點(diǎn)Bstll07I進(jìn)行所述線性化處理， 任選地，利用T7Message Machine試劑盒進(jìn)行所述體外轉(zhuǎn)錄， 任選地，在進(jìn)行所述體外轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)一步包括除雜純化的步驟。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，利用電轉(zhuǎn)或PEI法進(jìn)行所述轉(zhuǎn)染， 任選地，利用PEI法進(jìn)行所述轉(zhuǎn)染，其中，PEI與所述HPVE6抗原mRNA的混合質(zhì)量比為 3:1， 任選地，利用DC培養(yǎng)基進(jìn)行所述第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)和所述第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)， 任選地，所述DC培養(yǎng)基包含： 無血清細(xì)胞培養(yǎng)基； 100~1000U/ml的CTL4因子；以及 2體積％~10體積％的自體血清， 其中，所述血清來源于所述樣本， 任選地，所述無血清培養(yǎng)基為Takara的無血清培養(yǎng)基， 任選地，所述無血清培養(yǎng)基中添加有0. 5體積％~5體積％的抗生素，優(yōu)選慶大霉素， 任選地，進(jìn)行所述第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)4-5天，每2-3天半換液一次， 任選地，進(jìn)行所述第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)4-5天，每2-3天半換液一次。
5. -種制備靶向性免疫細(xì)胞群的方法，其特征在于，包括以下步驟： 提供樣本的外周血單個(gè)核細(xì)胞； 將所述樣本的外周血單個(gè)核細(xì)胞分離為淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞； 將所述淋巴細(xì)胞進(jìn)行活化培養(yǎng)，以便獲得經(jīng)過活化培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞； 將單核細(xì)胞進(jìn)行第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，以便獲得未成熟的DC細(xì)胞； 利用HPVE6抗原mRNA轉(zhuǎn)染所述未成熟的DC細(xì)胞，以便獲得經(jīng)過轉(zhuǎn)染的未成熟DC細(xì) 胞； 將所述經(jīng)過轉(zhuǎn)染的未成熟DC細(xì)胞進(jìn)行第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，以便獲得成熟的DC細(xì)胞；以 及 將所述成熟的DC細(xì)胞與所述經(jīng)過活化培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)，以便獲得靶向 性免疫細(xì)胞群。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述HPVE6抗原mRNA是通過以下步驟獲 得的： 制備HPVE6抗原cDNA質(zhì)粒，所述HPVE6抗原cDNA的核酸序列如SEQ ID NO :1所示； 將所述HPVE6抗原cDNA質(zhì)粒進(jìn)行線性化處理，以便獲得經(jīng)過線性化處理的HPVE6抗原 cDNA質(zhì)粒；以及 將所述經(jīng)過線性化處理的HPVE6抗原cDNA質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，以便獲得HPVE6抗原 mRNA, 任選地，以pcDNA3. 1載體為骨架載體，制備所述HPVE6抗原cDNA質(zhì)粒， 任選地，所述pcDNA3. 1載體具有BamhI、XbaI和Bstl 1071酶切位點(diǎn)， 任選地，基于酶切位點(diǎn)Bstll07I進(jìn)行所述線性化處理， 任選地，利用T7Message Machine試劑盒進(jìn)行所述體外轉(zhuǎn)錄， 任選地，在進(jìn)行所述體外轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)一步包括除雜純化的步驟。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，利用電轉(zhuǎn)或PEI法進(jìn)行所述轉(zhuǎn)染， 任選地，利用PEI法進(jìn)行所述轉(zhuǎn)染，其中，PEI與所述HPVE6抗原mRNA的混合質(zhì)量比為 3:1， 任選地，所述活化培養(yǎng)包括： 利用CTLl細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)所述淋巴細(xì)胞進(jìn)行第一活化培養(yǎng)24小時(shí)； 利用CTL2細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)經(jīng)過第一活化培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞進(jìn)行第二活化培養(yǎng)2-3天；以及 利用CTL3細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)經(jīng)過第二活化培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞進(jìn)行第三活化培養(yǎng)4-5天，每隔 2-3天等量補(bǔ)液一次， 任選地，所述CTLl細(xì)胞培養(yǎng)基包含： 無血清細(xì)胞培養(yǎng)基； 100~1000U/ml的CTLl因子；以及 2體積％~10體積％的自體血清， 所述CTL2細(xì)胞培養(yǎng)基包含： 無血清細(xì)胞培養(yǎng)基； 100~1000U/ml的CTL2因子；以及 2體積％~10體積％的自體血清， 所述CTL3細(xì)胞培養(yǎng)基包含： 無血清細(xì)胞培養(yǎng)基； 100~1000U/ml的CTL3因子；以及 2體積％~10體積％的自體血清， 其中，所述血清來源于所述樣本， 任選地，所述無血清培養(yǎng)基為Takara的無血清培養(yǎng)基， 任選地，所述無血清培養(yǎng)基中添加有0. 5體積％~5體積％的抗生素，優(yōu)選慶大霉素。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，利用DC培養(yǎng)基進(jìn)行所述第一誘導(dǎo)分化培 養(yǎng)和所述第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)， 任選地，所述DC培養(yǎng)基包含： 無血清細(xì)胞培養(yǎng)基； 100~1000U/ml的CTL4因子；以及 2體積％~10體積％的自體血清，其中，所述血清來源于所述樣本， 任選地，所述無血清培養(yǎng)基為Takara的無血清培養(yǎng)基， 任選地，所述無血清培養(yǎng)基中添加有0. 5體積％~5體積％的抗生素，優(yōu)選慶大霉素， 任選地，進(jìn)行所述第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)4-5天，每2-3天半換液一次， 任選地，進(jìn)行所述第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)4-5天，每2-3天半換液一次， 任選地，利用CTL3細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行所述混合培養(yǎng)6-8天，優(yōu)選7天， 任選地，所述CTL3細(xì)胞培養(yǎng)基包含： 無血清細(xì)胞培養(yǎng)基； 100~1000U/ml的CTL3因子；以及 2體積％~10體積％的自體血清， 其中，所述血清來源于所述樣本， 任選地，所述無血清培養(yǎng)基為Takara的無血清培養(yǎng)基， 任選地，所述無血清培養(yǎng)基中添加有0. 5體積％~5體積％的抗生素，優(yōu)選慶大霉素， 任選地，按照所述成熟的DC細(xì)胞與所述經(jīng)過活化培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞的體積比為1 :20進(jìn) 行所述混合培養(yǎng)。
9. 一種靶向性免疫細(xì)胞群，其是通過權(quán)利要求5-8任一項(xiàng)所述的方法制備獲得的。
10. 權(quán)利要求9所述的靶向性免疫細(xì)胞群，以及利用權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的制備 DC細(xì)胞的方法制備獲得的DC細(xì)胞在制備藥物中的用途，所述藥物用于抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、擴(kuò) 散、復(fù)發(fā)， 任選地，所述腫瘤為HPVE6抗原陽性腫瘤，優(yōu)選宮頸癌。
【專利摘要】本發(fā)明公開了DC細(xì)胞、靶向性免疫細(xì)胞群及其制備方法和用途，其中制備DC細(xì)胞的方法包括：將單核細(xì)胞進(jìn)行第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，以便獲得未成熟的DC細(xì)胞；利用HPVE6抗原mRNA轉(zhuǎn)染所述未成熟的DC細(xì)胞，以便獲得經(jīng)過轉(zhuǎn)染的未成熟DC細(xì)胞；以及將所述經(jīng)過轉(zhuǎn)染的未成熟DC細(xì)胞進(jìn)行第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，以便獲得成熟的DC細(xì)胞，其中，所述單核細(xì)胞是從樣本的外周血單個(gè)核細(xì)胞中分離獲得的。利用該發(fā)明能夠安全高效地制備DC細(xì)胞，且本發(fā)明的方法成本低、效率高、且能夠有效地解決細(xì)胞毒性問題，能夠有效用于免疫細(xì)胞治療或用于刺激同樣患者來源的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生富含大量CTL細(xì)胞的靶向性免疫細(xì)胞群，進(jìn)而用于腫瘤免疫治療后效果更好。
【IPC分類】C12N5-0783, A61K35-17, C12N15-87, A61K39-00, C12N5-10, A61P35-00
【公開號(hào)】CN104830785
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510225507
【發(fā)明人】楊光華, 李財(cái)新
【申請(qǐng)人】楊光華
【公開日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年5月5日