明的實(shí)施例，利用DC培養(yǎng)基進(jìn)行所述第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)和所述第二誘 導(dǎo)分化培養(yǎng)。由此，能夠有效誘導(dǎo)獲得DC細(xì)胞。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述DC培養(yǎng)基包含：無血清細(xì)胞培養(yǎng)基；100~1000U/ml 的CTL4因子；以及2體積％~10體積％的自體血清，其中，所述血清來源于所述樣本。由 此，培養(yǎng)效果好。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述無血清培養(yǎng)基為Takara的無血清培養(yǎng)基。根 據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，所述無血清培養(yǎng)基中添加有0. 5體積％~5體積％的抗生素，優(yōu) 選慶大霉素。由此，培養(yǎng)效果突出。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)行所述第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)4-5天，每2-3天半換液一次。 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)行所述第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)4-5天，每2-3天半換液一次。由此，培 養(yǎng)效果好。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種制備靶向性免疫細(xì)胞群的方法。根 據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括以下步驟：提供樣本的外周血單個(gè)核細(xì)胞；將所述樣本的 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離為淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞；將所述淋巴細(xì)胞進(jìn)行活化培養(yǎng)，以便獲得 經(jīng)過活化培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞；將單核細(xì)胞進(jìn)行第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，以便獲得未成熟的DC細(xì) 胞；利用PAP抗原mRNA轉(zhuǎn)染所述未成熟的DC細(xì)胞，以便獲得經(jīng)過轉(zhuǎn)染的未成熟DC細(xì)胞；將 所述經(jīng)過轉(zhuǎn)染的未成熟DC細(xì)胞進(jìn)行第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，以便獲得成熟的DC細(xì)胞；以及將所 述成熟的DC細(xì)胞與所述經(jīng)過活化培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)，以便獲得靶向性免疫細(xì) 胞群。
[0027] 發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的方法能夠有效制備獲得靶向性免疫細(xì)胞群，該 靶向性免疫細(xì)胞群不僅具有強(qiáng)大殺傷特定腫瘤細(xì)胞的CTL細(xì)胞，還有CIK、NK等免疫細(xì)胞， 能夠有效用于免疫細(xì)胞治療。此外，本發(fā)明的方法成本低、效率高，且能夠有效地解決細(xì)胞 毒性問題，獲得的靶向性免疫細(xì)胞群回輸患者后安全無毒。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述PAP抗原mRNA是通過以下步驟獲得的：制備PAP抗原 cDNA質(zhì)粒，所述PAP抗原cDNA的核酸序列如SEQIDNO:1所示；將所述PAP抗原cDNA質(zhì) 粒進(jìn)行線性化處理，以便獲得經(jīng)過線性化處理的PAP抗原cDNA質(zhì)粒；以及將所述經(jīng)過線性 化處理的PAP抗原cDNA質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，以便獲得PAP抗原mRNA。由此，能夠有效制備 獲得PAP抗原mRNA。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，以pcDNA3. 1載體為骨架載體，制備所述PAP抗原cDNA質(zhì) 粒。由此，制備效率高，效果好。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述pcDNA3. 1載體具有BamhI、Xbal和Bstll07I酶切位 點(diǎn)。由此，能夠有效進(jìn)行質(zhì)?？寺『秃罄m(xù)的線性化處理。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，基于酶切位點(diǎn)Bstll07I進(jìn)行所述線性化處理。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用ITMessageMachine試劑盒進(jìn)行所述體外轉(zhuǎn)錄。由此， 能夠有效進(jìn)行質(zhì)粒克隆和后續(xù)的線性化處理。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在進(jìn)行所述體外轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)一步包括除雜純化的步驟。由 此，有利于后續(xù)PAP抗原mRNA轉(zhuǎn)染的進(jìn)行。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用電轉(zhuǎn)或PEI法進(jìn)行所述轉(zhuǎn)染。由此，轉(zhuǎn)染效率高、效果 好。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用PEI法進(jìn)行所述轉(zhuǎn)染，其中，PEI與所述PAP抗原mRNA 的混合質(zhì)量比為3:1。由此，轉(zhuǎn)染效果突出。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述活化培養(yǎng)包括：利用CTL1細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)所述淋巴細(xì)胞 進(jìn)行第一活化培養(yǎng)24小時(shí)；利用CTL2細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)經(jīng)過第一活化培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞進(jìn)行第 二活化培養(yǎng)2-3天；以及利用CTL3細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)經(jīng)過第二活化培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞進(jìn)行第三活 化培養(yǎng)4-5天，每隔2-3天等量補(bǔ)液一次。由此，能夠有效使淋巴細(xì)胞活化，有利于后續(xù)靶 向性免疫細(xì)胞群的獲得。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述CTL1細(xì)胞培養(yǎng)基包含：無血清細(xì)胞培養(yǎng)基；
[0038] 100~1000U/ml的CTL1因子；以及2體積％~10體積％的自體血清，所述CTL2 細(xì)胞培養(yǎng)基包含：無血清細(xì)胞培養(yǎng)基；100~l〇〇〇U/ml的CTL2因子；以及2體積％~10體 積％的自體血清，所述CTL3細(xì)胞培養(yǎng)基包含：無血清細(xì)胞培養(yǎng)基；100~1000U/ml的CTL3 因子；以及2體積％~10體積％的自體血清，其中，所述血清來源于所述樣本。由此，活化 培養(yǎng)效果好。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述無血清培養(yǎng)基為Takara的無血清培養(yǎng)基。根據(jù)本 發(fā)明的另一些實(shí)施例，所述無血清培養(yǎng)基中添加有0. 5體積％~5體積％的抗生素，優(yōu)選慶 大霉素。由此，活化培養(yǎng)效果突出，淋巴細(xì)胞活化效果好，有利于后續(xù)靶向性免疫細(xì)胞群的 獲得。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用DC培養(yǎng)基進(jìn)行所述第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)和所述第二誘 導(dǎo)分化培養(yǎng)。由此，能夠有效誘導(dǎo)獲得DC細(xì)胞。
[0040] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述DC培養(yǎng)基包含：無血清細(xì)胞培養(yǎng)基；100~1000U/ml的CTL4因子；以及2體積％~10體積％的自體血清，其中，所述血清來源于所述樣本。由 此，培養(yǎng)效果好。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述無血清培養(yǎng)基為Takara的無血清培養(yǎng)基。根 據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，所述無血清培養(yǎng)基中添加有0. 5體積％~5體積％的抗生素，優(yōu) 選慶大霉素。由此，培養(yǎng)效果突出。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)行所述第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)4-5天，每2-3天半換液一次。 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)行所述第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)4-5天，每2-3天半換液一次。由此，培 養(yǎng)效果好。
[0042]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用CTL3細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行所述混合培養(yǎng)6-8天，優(yōu)選7天。 由此，能夠有效獲得靶向性免疫細(xì)胞群。
[0043]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述CTL3細(xì)胞培養(yǎng)基包含：無血清細(xì)胞培養(yǎng)基；100~1000U/ml的CTL3因子；以及2體積％~10體積％的自體血清，其中，所述血清來源于所述 樣本。由此，培養(yǎng)效果好。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述無血清培養(yǎng)基為Takara的無血清培 養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，所述無血清培養(yǎng)基中添加有〇. 5體積％~5體積％的 抗生素，優(yōu)選慶大霉素。由此，能夠高效地制備獲得靶向性免疫細(xì)胞群。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，按照所述成熟的DC細(xì)胞與所述經(jīng)過活化培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞 的體積比為1 :20進(jìn)行所述混合培養(yǎng)。由此，混合培養(yǎng)效果好，能夠高效地制備獲得靶向性 免疫細(xì)胞群。
[0045]此外，根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，本發(fā)明的制備靶向性免疫細(xì)胞群的方法還可 以包括以下步驟：
[0046] 第一步：抽取腫瘤患者靜脈外周血（50-100毫升）或采用血細(xì)胞分離機(jī)直接分離 出外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)。
[0047]第二步：經(jīng)培養(yǎng)，PBMC被分離為淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，備用； 利用PAP抗原mRNA轉(zhuǎn)染單核細(xì)胞，并利用細(xì)胞因子誘導(dǎo)成熟的樹突狀細(xì)胞（DC)產(chǎn)生。
[0048] 第三步：將成熟的DC細(xì)胞與淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，將淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成為具有抗原特 異性的、殺傷抗原陽性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，獲得靶向性免疫細(xì)胞群。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種靶向性免疫細(xì)胞群。根據(jù)本發(fā)明的 實(shí)施例，其是通過前面所述的制備靶向性免疫細(xì)胞群的方法制備獲得的。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā) 明的靶向性免疫細(xì)胞群不僅具有強(qiáng)大殺傷特定腫瘤細(xì)胞的CTL細(xì)胞，還有CIK、NK等免疫細(xì) 胞，且成本低、安全無毒，能夠有效用于免疫細(xì)胞治療。
[0050] 根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提供了靶向性免疫細(xì)胞群、以及利用前面所述 的制備DC細(xì)胞的方法制備獲得的DC細(xì)胞在制備藥物中的用途，所述藥物用于抑制腫瘤轉(zhuǎn) 移、擴(kuò)散、復(fù)發(fā)。
[0051] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述腫瘤為PAP抗原陽性腫瘤，優(yōu)選前列腺癌。
[0052] 需要說明的是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，由于mRNA無需啟動(dòng)子，不能無限制的擴(kuò)增，不會(huì)進(jìn)入 細(xì)胞核插入宿主細(xì)胞染色體上，無遺傳基因毒性，具很高的安全性等特點(diǎn)，因而本發(fā)明擬用 mRNA-DC-CTL方法制備DC細(xì)胞以及靶向性免疫細(xì)胞群（針對(duì)PAP的靶向性免疫細(xì)胞集群）， 以便用于腫瘤的免疫治療。本發(fā)明的方法突破了以往的刺激DC的藥物不能常規(guī)制備的局 限性。并且，在體外利用mRNA轉(zhuǎn)染DC而產(chǎn)生特異性多靶點(diǎn)CTL細(xì)胞的屬于第一次。
[0053] 具體地，本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)的至少之一：
[0054] 1、國際上首次構(gòu)建出PAPmRNA抗原。
[0055] 2、國際上首次利用PAP抗原mRNA轉(zhuǎn)染DC細(xì)胞來體外誘導(dǎo)獲得PAP特異性的靶向 免疫細(xì)胞群（富含CTL細(xì)胞）。
[0056] 3、本發(fā)明的靶向免疫細(xì)胞群包含：CTL細(xì)胞（CD8+，CD3+CD8+CD28+)，CIK細(xì)胞 (⑶3+⑶56+)，NK細(xì)胞（⑶3-⑶56+)，使其不僅具有強(qiáng)大殺傷特定腫瘤細(xì)胞的CTL細(xì)胞，還有 CIK