表達雞IgY分子Fc片段和禽流感病毒抗原的融合基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種表達雞IgY分子Fc片段和禽流感 病毒抗原的融合基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黏膜是大部分病原入侵宿主的主要部位，因此將外源抗原打靶到黏膜部位，從而 激發(fā)特異性的黏膜免疫應(yīng)答是抵抗病原入侵的一種重要策略。但是黏膜表面上皮細(xì)胞間 的緊密連接使分子很難滲入，其中的一個解決方法是將黏膜抗原靶向腸上皮細(xì)胞中的M細(xì) 胞-黏膜表面和外界環(huán)境交界處攝取抗原的一種特殊上皮細(xì)胞?？乖坏┍籑細(xì)胞攝取 即可快速移行至上皮細(xì)胞的基底部，與集合淋巴結(jié)相互作用。但是黏膜上皮細(xì)胞中M細(xì)胞 比例極低（1千萬個上皮細(xì)胞中只有1個M細(xì)胞)，使M細(xì)胞攝取抗原的總體效率較低，必須 采取新策略增加黏膜疫苗的高效性。
[0003] 最新研究表明，新生兒IgG Fc受體（FcRn)介導(dǎo)母體IgG通過胎盤或腸道運輸給 胎兒，還可以高效運輸抗原至黏膜表面，激發(fā)宿主產(chǎn)生較高的特異性免疫應(yīng)答。研究表明， IgG2a的Fc片段與HSV-2的gD蛋白融合表達后經(jīng)滴鼻免疫，此融合蛋白可以激發(fā)產(chǎn)生很強 的CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答；HIV病毒的Gag蛋白與IgG的Fc片段融合后滴鼻免疫同樣可以在 鼠的生殖道部位產(chǎn)生高水平的記憶性細(xì)胞免疫應(yīng)答。相似地，在禽類也有抗體IgY(相當(dāng)于 哺乳動物的IgG)的Fc片段受體，CHIR-AB1和FcRY，其中CHIR-AB1分布于雞的專業(yè)抗原遞 呈細(xì)胞如Dc細(xì)胞，B細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞表面，而且可以和雞IgY高親和性結(jié)合；另一類Fc 受體FcRY具有與哺乳動物FcRn-IgG相似的結(jié)合特性，另外，F(xiàn)cRY可以介導(dǎo)雞IgY抗體的 胞吞，從而介導(dǎo)母源抗體進入雞胚體內(nèi)。
[0004] 因此，基于在哺乳動物模型中的上述策略，我們對禽FcRY免疫功能提出一個新的 應(yīng)用：將雞IgY Fc片段與禽流感病毒抗原在球蟲中融合表達，得到穩(wěn)定蟲株后免疫雞群， 檢測其對球蟲和病毒抗原特異性的免疫應(yīng)答，并檢測攻毒后的病毒載量。若雞IgY分子Fc 片段與其受體相互作用后確實有如哺乳動物Fc高效運輸抗原的免疫功能，那么這種轉(zhuǎn)基 因球蟲的免疫則可以抵抗流感病毒的感染，在禽流感的預(yù)防有廣闊前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有黏膜疫苗運輸抗原的 障礙，以表達雞IgY分子Fc片段的轉(zhuǎn)基因球蟲為載體，提供一種新的抗禽流感免疫策略。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種表達雞I gY分子Fc片段和禽流感病毒 抗原蛋白（HA、NA、M2、NP)的融合基因。
[0007] 作為優(yōu)選，所述禽流感病毒抗原蛋白為禽流感病毒H9N2囊膜蛋白HA1。
[0008] 進一步地，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0009] 本發(fā)明還提供了含有前述融合基因的載體。
[0010] 進一步地，所述載體的構(gòu)建方法為：利用傳統(tǒng)的Trizol法分別提取禽流感病毒 H9N2和雞的總RNA;設(shè)計引物分別擴增得到禽流感病毒H9N2亞型的HA1基因片段和雞IgY 分子Fc基因片段；用搭橋PCR方法將HA1基因和Fc基因片段連接形成融合基因HAl-Fc; 亞克隆至克隆載體后對測序鑒定正確的HAl-Fc基因用限制性內(nèi)切酶Agel、SacII酶切，將 其連接至球蟲表達載體，得到載體pchFcRn，載體pchFcRn的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所 /_J、i〇
[0011] 其中，所述球蟲表達載體為pMDEAAssA。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因球蟲的構(gòu)建方法，其是將前述載體轉(zhuǎn)染和緩艾美耳球 蟲（Eimeria mitis)子孢子，接種至雞后利用抗球蟲藥物乙胺啼陡對表達二氫葉酸還原酶 突變基因（DHFR-TS3m)的重組子進行壓力篩選并連續(xù)傳代得到穩(wěn)定表達雞IgY分子Fc片 段和禽流感病毒H9N2囊膜蛋白HA1的轉(zhuǎn)基因蟲株。
[0013] 本發(fā)明還提供了根據(jù)所述構(gòu)建方法得到的轉(zhuǎn)基因球蟲。
[0014] 本發(fā)明還提供了前述融合基因在增強禽流感抗原在宿主雞腸道粘膜內(nèi)運輸效率 上的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明還提供了前述融合基因在禽類抗禽流感病毒上的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明還提供了前述轉(zhuǎn)基因球蟲在禽類抗禽流感病毒上的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0018](一)本發(fā)明首次將雞IgY分子Fc片段與禽流感蛋白融合表達于雞球蟲中，并利用 轉(zhuǎn)基因球蟲實現(xiàn)了禽流感抗原在宿主雞腸道粘膜的高效運輸，進而實現(xiàn)了抗禽流感預(yù)防功 能。
[0019](二）本發(fā)明所獲得的表達雞IgY分子Fc片段及禽流感病毒相應(yīng)抗原的轉(zhuǎn)基因球 蟲使用簡單，成本低廉，應(yīng)用前景廣闊。
[0020] 本發(fā)明利用表達雞IgY分子Fc片段和禽流感病毒抗原的重組球蟲免疫雞，通過雞 IgY分子Fc片段介導(dǎo)的抗原運送作用，增強粘膜免疫系統(tǒng)對禽流感的應(yīng)答。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明融合表達H9N2禽流感病毒HA1與雞IgY Fc片段的轉(zhuǎn)基因和緩艾美 耳球蟲的構(gòu)建與鑒定。
[0022] 其中：（A)含有雞IgY分子Fc片段和H9N2禽流感病毒H9N2亞型HA1蛋白融合基 因的球蟲表達載體pchFcRn的構(gòu)造圖；（B)所獲得的轉(zhuǎn)基因球蟲表達的報告基因黃色熒光 蛋白，bar=10 y m;(C)轉(zhuǎn)基因球蟲的基因組鑒定及蛋白表達情況，a為用抗HA1多抗鑒定， b為用抗雞IgY分子Fc抗體鑒定；（D)轉(zhuǎn)基因球蟲的間接免疫熒光鑒定圖，分別在穿膜和不 穿膜的處理方式下用抗HA1多抗和抗雞IgY分子Fc抗體鑒定；（E)轉(zhuǎn)基因球蟲的免疫組化 鑒定。
[0023] 圖2為本發(fā)明融合表達H9N2禽流感病毒HA1與雞IgY Fc片段的轉(zhuǎn)基因和緩艾美 耳球蟲免疫SPF雞后的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。
[0024] 其中：（A)三次免疫后血清中針對流感病毒HA1的ELISA反應(yīng)；（B)第三次免疫后 血清中產(chǎn)生的中和抗體滴度；中和抗體以能保護50%組織培養(yǎng)細(xì)胞免于被感染的，能中和 100個TCID50病毒血清稀釋度的倒數(shù)的log2值表示；（C)第三次免疫后10天外周血中分 泌IFN的淋巴細(xì)胞的數(shù)量。
[0025] 圖3為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因球蟲免疫SPF和攻毒后第