次，得到處理過(guò)的纖維素，經(jīng)80°C干燥6h后，加入纖維素酶在pH為4. 8的醋酸-醋 酸鈉緩沖溶液中反應(yīng)24h。抽濾所得水解液用于發(fā)酵。
[0025] 所述離子液體為：1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽、1-乙基-3-甲基咪唑氯鹽、1-乙 基-3-甲基咪唑溴鹽、1- 丁基-3-甲基咪唑溴鹽、1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯鹽、1-辛 基-2,3-二甲基咪唑四氟硼酸鹽、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽、1-乙基-3-甲基咪唑 四氟鹽。
[0026] 分析方法：
[0027] 樣品處理：發(fā)酵液在室溫下12000RPM，離心lOmin，取上清，然后用孔徑為0. 22ym 的無(wú)菌濾膜過(guò)濾，用高效液相色譜（HPLC)檢測(cè)發(fā)酵液脂肪酸及還原糖濃度。
[0028] 有機(jī)酸測(cè)定：：發(fā)酵液中的各種有機(jī)酸的濃度由液相色譜分析儀檢測(cè)，檢測(cè)器為紫 外檢測(cè)器（AgilentTechnologies，G1315D)及示差折光檢測(cè)器（AgilentTechnologies， G1362A)，分析柱為HPX-87Hcolumn(300mmX4.6mm，Bio-Rad)。柱溫為 25°C，流動(dòng)相為pH 2. 5, 5mmol/LH2S04溶液，流速為 0? 6mL/min，進(jìn)樣量為 20yL。
[0029]還原糖測(cè)定：3,5-二硝基水楊酸法（DNS)，測(cè)定時(shí)以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。取182g 酒石酸鉀鈉溶于500mL熱水中，于熱溶液中依次加入262mL的2mol/LNaOH溶液、6. 3g3， 5-二硝基水楊酸、5. 0g苯酷、5. 0g無(wú)水亞硫酸鈉，攪拌至試劑完全溶解。待溶液冷卻后，轉(zhuǎn) 入到1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，貯存于棕色試劑瓶中，避光保存一周后使用。 繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。在比色管中加入1. 5mL的DNS試劑和2mL反應(yīng)液樣品，在沸水中加 熱5min。反應(yīng)完成后冷卻至室溫。用JASC0-530型分光光度計(jì)，在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品 的吸光度。
[0030] 生物量測(cè)定：生物量采用上海精密科學(xué)儀器公司生產(chǎn)的723N型可見光分光光度 計(jì)測(cè)定，使用波長(zhǎng)為600nm。樣品先用0. 2MHCI進(jìn)行處理，溶解所含的MgC03,120 00RPM離 心l〇min，再用蒸餾水洗三次，以除去所含的色素及雜質(zhì)。
[0031] 脂肪酸產(chǎn)率（％ )定義為每消耗lg還原糖所產(chǎn)生脂肪酸的克數(shù)。
[0032] 本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0033] 以竹子粉為原料發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酸，游離脂肪酸濃度可達(dá)3~15g/L，糖的利用率為 60~90 %，游離脂肪酸的產(chǎn)率達(dá)到了 20 %~30 %，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到0. 063~0. 313g/L-h。
[0034] 利用廉價(jià)的竹子粉原料替代昂貴的葡萄糖或糧食作物為碳源發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酸，一 方面能充分利用大量的竹子資源，以防止資源的浪費(fèi)，同時(shí)，可以節(jié)約葡萄糖等昂貴的資 源，減少生產(chǎn)的成本；另一方面可以調(diào)節(jié)糖價(jià)，保障農(nóng)民權(quán)益。
[0035] 利用可再生生物質(zhì)資源生產(chǎn)脂肪酸，可以降低發(fā)酵生產(chǎn)成本，與石化法處理得到 及動(dòng)植物來(lái)源的脂肪酸進(jìn)行市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)。在緩解化學(xué)合成脂肪酸的石化資源緊張問題的同 時(shí)，對(duì)環(huán)境友好，可再生資源的利用，也是走可持續(xù)發(fā)展道路的必然選擇。
【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1是本發(fā)明采用5L發(fā)酵罐分批發(fā)酵水解液產(chǎn)脂肪酸的發(fā)酵結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 以下是本發(fā)明所述的利用竹子粉為原料發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酸的方法的具體實(shí)施例，但 對(duì)本發(fā)明沒有限制。
[0038] 實(shí)施例1
[0039] 不同處理方式得到的水解液對(duì)竹子粉發(fā)酵產(chǎn)脂肪酸的影響
[0040] 分別通過(guò)酸解法、酶解法兩種方法利用離子液體對(duì)竹子粉進(jìn)行水解，得到木質(zhì)纖 維素水解液。
[0041] (1)酸解法：足量離子液體熔融后，與竹子粉、氯化銅和10% (v/v)鹽酸在l〇〇°C 攪拌反應(yīng)4~5h，抽濾后加入50% (w/w)氫氧化鈉使其分層，快速混勾30min，使用離心機(jī) 快速離心所得下層清液即為用于發(fā)酵的水解液。
[0042] (2)酶解法：足量離子液體與竹子粉在120°C攪拌反應(yīng)3h后，加水抽濾，并用水洗 4~6次，得到處理過(guò)的纖維素，經(jīng)80°C干燥6h后，加入纖維素酶在pH為4. 8的醋酸-醋 酸鈉緩沖溶液中反應(yīng)24h。抽濾所得水解液用于發(fā)酵。
[0043] 將大腸桿菌DQ430的菌株的平板在培養(yǎng)20h后，用接種環(huán)接一環(huán)至30mL種子培養(yǎng) 基中，在普通培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)18~20h，按照8%接種量接入初始總還原糖20g/L發(fā)酵培 養(yǎng)基的250mL三角瓶，裝液量為40mL，30°C有氧發(fā)酵培養(yǎng)72h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1。
[0044]表1不同處理方法對(duì)大腸桿菌產(chǎn)脂肪酸的影響
[0045]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用竹子粉為原料發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酸的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將竹子粉碎得到竹子粉，將竹子粉過(guò)80目篩子，基于離子液體進(jìn)行酸水解或酶水 解竹子粉得到木質(zhì)纖維素水解液直接用于配置培養(yǎng)基或置于_20°C冰箱備用； (2) 將新鮮的或解凍后的水解液加水調(diào)整總糖濃度至10~50g/L，加入氮源、無(wú)機(jī)鹽、 PH緩沖劑配置成脂肪酸發(fā)酵培養(yǎng)基； (3) 將平板上的大腸桿菌（Escherichia coli)接入種子培養(yǎng)基中，在普通培養(yǎng)箱培養(yǎng) 16 ~20h。 所述的種子培養(yǎng)基的成分及其濃度為：蛋白陳10~20g/L，酵母粉5~10g/L，NaCl 5 ~10g/L。 (4) 將培養(yǎng)好的大腸桿菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5~10% (v/v)，在有氧環(huán)境 中發(fā)酵，pH緩沖劑調(diào)節(jié)pH在6. 0~7. 0,并在30~37 °C發(fā)酵24~72h，即可得到脂肪酸。 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及其濃度為：總糖10~50g/L，氮源10~40g/L，K2HPO4 1~ 5g/L，CaCl2 0· 5 ~lg/L，NaCl 0· 5 ~2g/L，（NH4)2SO4 0· 5 ~2g/L，MgCl2 0· 5 ~lg/L。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用竹子粉為原料發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酸的方法，其特征在于，所 述的pH緩沖劑是碳酸鹽、氨水、NaOH，所述的碳酸鹽為堿式碳酸鎂或碳酸鈉。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用竹子粉為原料發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酸的方法，其特征在于，所 述的氮源包括有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源；所述的有機(jī)氮源包括酵母粉、蛋白胨、玉米漿、豆餅粉， 所述的無(wú)機(jī)氮源包括尿素、硫酸銨。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用竹子粉為原料發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酸的方法，其特征在于，所 述的發(fā)酵方式采用分批發(fā)酵、分批補(bǔ)料發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的離子液體對(duì)竹子粉處理的兩種方法，包括酸解法和酶解法。
6. 根據(jù)權(quán)利要5所述的利用竹子粉為原料發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酸衍生物的其它方法。
【專利摘要】一種利用木質(zhì)纖維素離子液體水解液發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酸的方法，利用大腸桿菌菌株DQ430在有氧條件下，加水調(diào)節(jié)水解液的總糖濃度在10～50g/L，分批或分批補(bǔ)料發(fā)酵產(chǎn)脂肪酸，發(fā)酵24～72h，脂肪酸濃度可達(dá)3～15g/L，糖的利用率為60～90％，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到0.063～0.313g/L-h，本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)是利用竹子粉作為原料替代昂貴的葡萄糖作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酸，利用可再生生物質(zhì)資源，對(duì)環(huán)境友好，可緩解化學(xué)合成脂肪酸的石化資源緊張問題。
【IPC分類】C12P7-40, C12R1-19
【公開號(hào)】CN104830916
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510242685
【發(fā)明人】王丹, 秦丹丹, 鄒環(huán)澤, 汪楠, 周小華
【申請(qǐng)人】重慶大學(xué)
【公開日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年5月6日