一種核苷類藥物中間體2’-脫氧鳥苷的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及生物催化法制備2’ -脫氧鳥苷的技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種核苷類藥物中間體2’ -脫氧鳥苷的生產(chǎn)方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]2 '-脫氧鳥苷是一種天然的脫氧核苷，可直接用于制備組合脫氧核苷藥物或者作為化學(xué)試劑用于生化研宄；同時可作為中間體用于合成一些抗病毒核苷類藥物以及分子標(biāo)記物，如文獻(xiàn)(Journal of Medicinal Chemistry, 1985, 28:1194-1198)以 2’-脫氧鳥苷原料合成8-溴-2’ -脫氧鳥苷和8-羥基-2’ -脫氧鳥苷等重要分子標(biāo)記物；文獻(xiàn)(Tetrahedron Letters, 1982, 23 (22):2253-2256, 1982 Tetrahedron Letters, 1990,31 (3):319-322)中報道了合成2’-脫氧鳥苷的6位衍生物，如6-甲氧基、6-氨基等系列重要抗腫瘤的2’ -脫氧鳥苷衍生物；另外中國專利CN201110114010公開報道了采用2’ -脫氧鳥苷為原料合成致癌或抗癌過程中的重要分子標(biāo)記物N7-鳥嘌呤烷化物。
[0004]由于采用化學(xué)法合成2’ -脫氧鳥苷的收率極低，因此，目前，工業(yè)上2’ -脫氧鳥苷生產(chǎn)方法采用DNA水解法，即從DNA水解液中萃取與分離得到。因此，人們開始著手于采用生物法來制備2’ -脫氧鳥苷。
[0005]中國專利CN201010611733和文獻(xiàn)(藥物生物技術(shù)，2011，18⑵:119-123)報道了以鳥苷酸(5’ -單磷酸鳥苷)為原料，采用乙酰短桿菌的核苷磷酸化酶和磷酸單酯酶雙酶作用下催化合成2’ -脫氧鳥苷，該方法除產(chǎn)物2’ -脫氧鳥苷外，還生成了鳥苷，不利于后續(xù)分離純化。
[0006]日本有機合成藥品工業(yè)株式會社的三上洋一(Yoichi Mikanmi )等(中國專利CN200510137532、CN200510137533、CN200510137534、CN01110115、US20010034047AUUS20040067558A1以及US20040072303A1等同族專利)報道了先將鳥嘌呤與乙二醛進(jìn)行反應(yīng)生成乙二醛-鳥嘌呤復(fù)合體來提高鳥嘌呤的溶解度，轉(zhuǎn)化完畢后再經(jīng)堿解脫去乙二醛基團(tuán)生成2’ -脫氧鳥苷；該方法雖然一定程度上提高2’ -脫氧鳥苷的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率，但所用乙二醛對人體健康以及環(huán)境僅有危害。
[0007]歐洲專利EP1457568、美國專利 US20050170470A1 和世界專利 W02003057895A1 采用鳥苷、5’ -單磷酸鳥苷、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤作為脫氧核糖受體來制備2 ’ -脫氧鳥苷或2 ’ -脫氧鳥苷前提物(如5 ’ -單磷酸2 ’ -脫氧鳥苷、2-氨基-6-氯-2 ’ -脫氧核苷、2，6-二氨基_2’ -脫氧核苷)前提物再經(jīng)處理得到2’ -脫氧鳥苷，如5’ -單磷酸2’ -脫氧鳥昔水解脫去5’ -憐酸基得到2’ -脫氧鳥昔，而2_氛基-6-氣_2’ -脫氧核昔和2，6_ 二氨基-2’ -脫氧核苷則再腺苷脫氨酶作用下，將6-氯(-Cl)或6-氨基(-N2H)位替代基團(tuán)轉(zhuǎn)換成6-酮基(=0)。
[0008]美國專利US6197552 和文獻(xiàn)(Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic,2000，10:207 - 213)同樣報道了采用2，6- 二氨基嘌呤作為脫氧糖基受體合成2’ -脫氧鳥苷前提物 2，6-二氨基 _2’ -脫氧核苷。文獻(xiàn)(B1sc1.B1technol.B1chem., 2003,67
(5):989 - 995)報道了采用2-氨基-6-氯嘌呤作為脫氧糖基受體合成2’ -脫氧鳥苷前提物2-氨基-6-氯-2’ -脫氧核苷。
[0009]但由于鳥嘌呤難溶于水，這是鳥嘌呤作為糖基受體的瓶頸之處，為了提高2’ -脫氧鳥苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)率，關(guān)鍵措施是提高鳥嘌呤在轉(zhuǎn)化體系的溶解度。但是從上述報道來看，基本上很少關(guān)注于如何提高鳥嘌呤在轉(zhuǎn)化體系中溶解度的問題，而是著重鳥嘌呤的替代前提物(如鳥苷酸、鳥苷、2-氨基-6-氯嘌呤以及2，6- 二氨基嘌呤)方面，雖然這些替代前提物與鳥嘌呤相比，在轉(zhuǎn)化體系溶解度大大提高，使得2’ -脫氧鳥苷終轉(zhuǎn)化產(chǎn)率一定程度上得到提高，但是存在轉(zhuǎn)化率偏低、替代前提物不易獲得以及副產(chǎn)物增加等缺陷。
[0010]雙水相系統(tǒng)是指將兩種不同水溶性聚合物的水溶液混合時，當(dāng)聚合物濃度達(dá)到一定值時，體系會自然地分成互不相溶的兩相，兩相中均含有水分，構(gòu)成了雙水相體系。雙水相技術(shù)早期主要用于生物分子和細(xì)胞的分離與純化，近年來開始應(yīng)用于微生物催化過程，為酶催化過程引入了一種全新的反應(yīng)體系。
[0011]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的在于提供一種核苷類藥物中間體2’-脫氧鳥苷的生產(chǎn)方法。該方法將雙水相系統(tǒng)應(yīng)用到生物催化制備2’ -脫氧鳥苷的工藝中，解決以往鳥嘌呤在轉(zhuǎn)化體系中溶解度低的瓶頸問題，可大大增加鳥嘌呤溶解度，大副度提高轉(zhuǎn)化率。
[0013]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一種核苷類藥物中間體2’ -脫氧鳥苷的生產(chǎn)方法，是采用產(chǎn)脫氧核苷核糖轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵乳桿菌CGMCC 1.1880菌體漿狀物為生物催化劑，在聚乙二醇(PEG) /無機鹽雙水相轉(zhuǎn)化體系，以胸苷和鳥嘌呤為原料進(jìn)行酶促反應(yīng)，最后獲得2’ -脫氧鳥苷。
[0014]所述的雙水相轉(zhuǎn)化體系中所用多聚物為聚乙二醇，所選的種類有PEG4000、PEG8000、PEG10000, PEG15000 和 PEG20000。其優(yōu)選為 PEG10000 和 PEG15000，其最優(yōu)選為PEG10000。所述聚乙二醇的濃度為25g/L-55g/L，包括25g/L、45g/L和55g/L，優(yōu)選PEG10000的的濃度為45g/L。
[0015]本發(fā)明雙水相轉(zhuǎn)化體系中所用無機鹽為磷酸鹽，所選的鹽種類有磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉和磷酸二氫錢，優(yōu)選為磷酸二氫鉀。磷酸鹽的濃度為30g/L-60g/L，包括30g/L、45g/L和60g/L，優(yōu)選磷酸二氫鉀的濃度為45g/L。
[0016]本發(fā)明所用的底物為胸苷和鳥嘌呤，其中胸苷濃度為16.5g/L，鳥嘌呤所選的濃度為 10.3g/L-18.0g/L，包括 10.3g/L、15.2g/L 和 18.0g/L，優(yōu)選濃度為 15.2g/L ；β-胸苷和鳥嘌呤摩爾比為1:1-2，包括1:1、1:1.5和1:2，優(yōu)選的比例為1:1.5。
[0017]β-胸苷是目前五種脫氧核苷(2’_脫氧腺苷、2’-脫氧尿苷、2’-脫氧胞苷、2’-脫氧鳥苷和胸苷)中最易得、價廉的脫氧糖基供體，而鳥嘌呤相比于其它含鳥嘌呤結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，如鳥苷、鳥苷酸或者2，6_ 二氨基嘌呤等，是最為直接、易得和價廉的脫氧核糖受體，因此，采用生物催化法制備2’ -脫氧鳥苷，鳥嘌呤和β-胸苷作為初始底物是最理想的組入口 ο
[0018]本發(fā)明的積極效果體現(xiàn)在: (一)、該方法將雙水相系統(tǒng)應(yīng)用到生物催化制備2’-脫氧鳥苷的工藝中，解決以往鳥嘌呤在轉(zhuǎn)化體系中溶解度低的瓶頸問題，可大大增加鳥嘌呤溶解度，大副度提高轉(zhuǎn)化率。
[0019](二)、本發(fā)明中的生物催化法生產(chǎn)2’ -脫氧鳥苷，產(chǎn)率最大達(dá)到可達(dá)16.lg/L，β-胸苷轉(zhuǎn)化率可達(dá)89%。
[0020]【具體實施方式】:
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述實施例。
[0021]下述實施例中如無特殊說明所用方法均為常規(guī)方法，所用試劑均可從商業(yè)途徑獲得。
[0022]由于產(chǎn)脫氧核苷核糖轉(zhuǎn)移酶的菌株發(fā)酵乳桿菌CGMCC 1.1880 (CGMCC為中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microb1logical Culture Collect1nCenter)的簡稱)的斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件采用本領(lǐng)域公知的技術(shù)，下面具體實施例菌采用統(tǒng)一的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。
[0023]斜面培養(yǎng)基組成(g/L)以及培養(yǎng)條件:
葡萄糖糖5、酵母浸粉10、磷酸氫二鉀1、七水硫酸鎂0.5、硫酸錳0.01，甘油5、酶解酪蛋白胨2、瓊脂25、pH值7.5 ;培養(yǎng)溫度35°C、，培養(yǎng)24-48小時。
[0024]種子培養(yǎng)基組成(