一種流加混合氨基酸母液提高桿菌肽效價的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵的技術領域，具體涉及一種流加混合氨基酸母液提高桿菌肽效價的方法。
【背景技術】
[0002]桿菌肽屬多肽類抗生素，其結構是由12個氨基酸組成含有噻唑環(huán)的多肽復合體，它許多異構物，分別為桿菌肽八七為為為為為和Eo其中A組分分子式為C66Hltl3N17O16S5,在所有的異構體中，其活性最高，含量也最為豐富。
[0003]桿菌肽是目前國內外廣泛用于飼料中的一種新型的理想廣譜抗菌素，它能夠有效抑制G+和G 一細菌，如金黃色葡萄球菌、鏈球菌等。作用機理是由于它是類脂質焦磷酸的特異性抑制劑，能抑制細胞壁所合成的脫磷化過程，影響磷脂載體的轉運及向細胞壁支架輸送粘肽，從而抑制細胞壁的合成；另一方面是與敏感菌的細胞膜結合，損傷細胞膜，使細胞膜的通透性增加，導致細胞質外流；其次是干擾敏感菌細胞內原漿蛋白的合成。具有抗菌譜廣、排泄快、畜禽吸收量少、安全性評估良好、不產生耐藥性等很多優(yōu)良特性，是飼料添加劑中傳統(tǒng)抗生素的有效替代品，已被應用于生物表面活性劑、飼料添加劑、食品防腐劑和作為生物學的研宄工具等。
[0004]目前桿菌肽的工業(yè)生產主要通過微生物發(fā)酵法制得，地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)是目前廣泛應用的工業(yè)生產菌種。桿菌肽的發(fā)酵生產過程研宄國外報道較多，國內相關報道不多，且發(fā)酵水平不高。我國的桿菌肽發(fā)酵生產始于20世紀60年代，隨著我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)的興起，桿菌肽于上個世紀90年代開始大量生產，以地衣芽孢桿菌為菌種，以玉米淀粉、豆柏粉為主要碳、氮源，培養(yǎng)溫度為37°C，經30-40h耗氧發(fā)酵培養(yǎng)生物合成桿菌肽，但發(fā)酵水平不高，生產能耗和生產成本高。目前的研宄也主要集中在菌種的選育和發(fā)酵條件的優(yōu)化方面，但是未取得突破行的進展，與國外報道的1200u/ml的水平相差還是很大，我國桿菌肽發(fā)酵工業(yè)的生產水平亟待提高。
[0005]發(fā)明專利申請?zhí)枮?01210352122.8的專利“一種利用氧載體提高發(fā)酵液中桿菌肽效價的方法”，提出了在微生物發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氧載體，是通過增加發(fā)酵液中氧氣的容量，提高氧氣傳遞速率，提高桿菌肽的產量，但是其需要用特定的地衣芽孢桿菌來進行發(fā)酵，而且其對桿菌肽的產量并沒有大幅度的提高，桿菌肽的產量依然很小，不能滿足桿菌肽的效價需求。發(fā)明專利申請?zhí)枮?01410163014.9的專利“一種連續(xù)流加補料分批發(fā)酵提高桿菌肽效價”，提出在發(fā)酵的過程中補入“豆柏粉、玉米粉、玉米淀粉、玉米漿、葡萄糖”此專利中補入的補料提供的是生長代謝所需的營養(yǎng)物質，是在生長期補入，該時期加入的補料使桿菌肽效價有所提高，但是依然不能達到國外的效價水平，桿菌肽發(fā)酵工業(yè)的生產水平依然亟待提高。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明提供了一種在發(fā)酵過程中流加混合氨基酸做為前體物質來提高桿菌肽效價的方法，其目的在于克服現有技術的不足，提高發(fā)酵單位，縮小與國外技術水平的差距，降低生產能耗和生產成本，本發(fā)明為實現其目的采用的技術方案是:
[0007]一種流加混合氨基酸母液提高桿菌肽效價的方法，在發(fā)酵培養(yǎng)的過程中，流加補入混合氨基酸母液，所述混合氨基酸母液的成分包含L-賴氨酸、L-異亮氨酸、D-谷氨酸、水。
[0008]當發(fā)酵時間為10_16h時，開始流加補入混合氨基酸母液，直至發(fā)酵終止。
[0009]所述混合氨基酸母液的流加速度為每小時流加發(fā)酵液體積的0.25 % -0.35 %，流加總量為發(fā)酵液總體積的8% -10%。
[0010]所述的混合氨基酸母液中以質量體積比計，L-賴氨酸的含量為:4.8% -6%。
[0011]所述的混合氨基酸母液中以質量體積比計，L-異亮氨酸的含量為:9% -12%。
[0012]所述的混合氨基酸母液中以質量體積比計，D-谷氨酸的含量為:3% -6%。
[0013]一種流加混合氨基酸母液提高桿菌肽效價的方法，具體的操作步驟為:
[0014]a、種子培養(yǎng):將地衣芽孢桿菌菌懸液接種于裝有種子培養(yǎng)基的種子罐中，在溫度36-38°C、轉速590-610rpm、通氣量0.4-0.6vvm的條件下培養(yǎng)15_17h，得到種子液；
[0015]b、發(fā)酵培養(yǎng):將步驟a中制備的種子液按照體積比10%的接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在溫度36-38°C、轉速590-610rpm、通氣量0.9-1.1vvm的條件下進行發(fā)酵，培養(yǎng)4h后，以0.4L/h的速率勻速流加補料，所述補料的成分及含量以質量體積比計為豆柏粉8 %、玉米粉I %、玉米淀粉2 %、玉米漿0.5 %、葡萄糖6 %、余量為水的補料，共流加4L補料，補料結束后控制pH7.0-7.5，39_41h終止發(fā)酵；
[0016]C、流加混合氨基酸母液:發(fā)酵進行到10_16h后，開始流加混合氨基酸母液，直至發(fā)酵終止，得到桿菌肽；
[0017]d、檢測發(fā)酵效價:發(fā)酵結束后檢測桿菌肽的發(fā)酵單位。
[0018]所述的步驟a種子培養(yǎng)中種子培養(yǎng)基的成分與用量為:以質量體積比計，黃豆餅粉3 %、玉米粉2 %、玉米淀粉I %、玉米漿0.5%、硫酸銨0.15%、碳酸鈣0.3%，余量為水，調節(jié)培養(yǎng)基的pH為6.8。
[0019]所述的步驟b發(fā)酵培養(yǎng)中發(fā)酵培養(yǎng)基的成分與用量為:以質量體積比計，豆柏粉
9%、玉米粉2 %、玉米淀粉3 %、硫酸銨0.3 %、硫酸鎂0.003 %、碳酸鈣0.5 %，余量為水，調節(jié)培養(yǎng)基的PH為7.2。
[0020]所述的步驟b發(fā)酵培養(yǎng)中發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為發(fā)酵罐容積的50-80%。
[0021]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供的方法提高了發(fā)酵水平，達到了國內外的桿菌肽發(fā)酵的最高水平，并且所使用的混合氨基酸母液成分常見易得，價格低廉，控制簡便，可以運用于大規(guī)模生產，降低了生產能耗和生產成本。
[0022]本發(fā)明通過添加氨基酸母液的方法，強化了產物的合成方向，使得目標產物的含量大幅度提高。本發(fā)明經過長期的研宄，總結發(fā)現只有在發(fā)酵10_16h (尤以13h最好)這個時間內補加氨基酸母液結合在生長期結束后補料的方式才會使得發(fā)酵液的效價達到國外的水平，實現發(fā)酵單位為1270u/ml的高效價，這個時間之外的補加會被當成氮源利用掉，參與菌體的生長代謝或能量代謝，不參與效價的提高，或減弱效價的提高。
[0023]本發(fā)明經過長期的創(chuàng)造性研宄，總結出:必須嚴格把控混合氨基酸母液中L-賴氨酸、L-異亮氨酸、D-谷氨酸的用量比例，用量比例改變都會影響發(fā)酵液效價，L-賴氨酸、L-異亮氨酸、D-谷氨酸的用量多一是會造成營養(yǎng)物質飽和效價不會再提高，二是會造成抑制、阻遏作用，發(fā)酵液效價不僅不會提高反而會下降，這是經過長期的創(chuàng)造性研宄發(fā)現總結的，并非一朝一夕的理論實驗得到的；L-賴氨酸、L-異亮氨酸、D-谷氨酸的用量少，發(fā)酵液效價無法提高或者提高幅度很小，因而嚴格控制L-賴氨酸、L-異亮氨酸、D-谷氨酸的用量比例至關重要。
【具體實施方式】
[0024]本發(fā)明提供了一種在發(fā)酵過程中流加混合氨基酸做為前體物質來提高桿菌肽效價的方法，其目的在于克服現有技術的不足，提高發(fā)酵單位，縮小與國外技術水平的差距，降低生產能耗和生產成本，下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步的說明。
[0025]實施例1.不補料制備桿菌肽
[0026]a、種子培養(yǎng):將地衣芽孢桿菌菌懸液接種于裝有種子培養(yǎng)基的種子罐中，在溫度37°C、轉速600rpm、通氣量0.5vvm的條件下培養(yǎng)16h ；
[0027]b、發(fā)酵培養(yǎng):將步驟a中制備的種子液按照體積比10%的接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在溫度37°C、轉速600rpm、通氣量1.0vvm的條件下進行發(fā)酵，培養(yǎng)4h后，開始以0.4L/h的速率勻速流加成分及含量為豆柏粉8%、玉米粉1%、玉米淀粉2%、玉米漿0.5%、葡萄糖6%、余量為水的補料(以質量體積比計)，共流加4L補料，補料結束后調節(jié)轉速控制PH7.0-7.5，40h終止發(fā)酵，作為對照。
[0028]C、檢測發(fā)酵單位:發(fā)酵結束后用HPLC法檢測桿菌肽的發(fā)酵單位為981u/ml。
[0029]實施例2.在發(fā)酵過程中補入L-賴氨酸。
[0030]a、種子培養(yǎng):將地衣芽孢桿菌菌懸液接種于裝有種子培養(yǎng)基的種子罐中，在溫度37°C、轉速600rpm、通氣比0.5vvm的條件下培養(yǎng)16h ；
[0031]b、發(fā)酵培養(yǎng):將步驟a中制備的種子液按照體積比10%的接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在溫度37°C、轉速600rpm、通氣比1.0vvm的條件下進行發(fā)酵，培養(yǎng)4h后，開始以0.4L/h的速率勻速流加成分及含量為豆柏粉8%、玉米粉1%、玉米淀粉2%、玉米漿0.5%、葡萄糖6%、余量為水的補料(以質量體積比計)，共流加4L補料，補料結束后調節(jié)轉速控制PH7.0-7.5，40h終止發(fā)酵；
[0032]C、流加氨基酸母液:發(fā)酵進行到13h后，開始流加混合氨基酸母液，40h發(fā)酵結束停止流加，氨基酸母液的含量為:以質量體積比計，L-賴氨酸5%、余量為水，流加速率為每小時流加發(fā)酵液體積的0.33%，勻速流加，流加總量為發(fā)酵液總體積的10%。
[0033]d、檢測發(fā)酵單位:發(fā)酵結束后HPLC檢測桿菌肽的發(fā)酵單位為1120u/ml，比對照提尚 14.17 % ο
[0034]實施例3.在發(fā)酵過程中補入L-異亮氨酸
[0035]a、種子培養(yǎng):將地衣芽孢桿菌菌懸液接種于裝有種子培養(yǎng)基的種子罐中，在溫度37°C、轉速600rpm、通氣比0.5vvm的條件下培養(yǎng)16h ；
[0036]b、發(fā)酵培養(yǎng):將步驟a中制備的種子液按照體積比10%的接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在溫度37°C、轉速600rpm、通氣比1.0vvm的條件下進行發(fā)酵，培養(yǎng)4h后，開始以0.4