一種混合菌種微生物轉(zhuǎn)化法高效合成l-茶氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種混合菌種微生物轉(zhuǎn)化法高效合成L-茶氨酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]茶氨酸(Theanine)是茶葉中的特征氨基酸，也是茶葉的呈味物質(zhì)之一。它是1950年由日本酒戶彌二郎從玉露茶新梢中發(fā)現(xiàn)的，并命名為茶氨酸(Theanine)。一般干茶葉中茶氨酸的含量為1%_2%。從發(fā)現(xiàn)到目前為止，除了在蕈、茶梅、蘑菇、油茶、紅山茶等中檢測出微量存在外，在其他植物中尚未發(fā)現(xiàn)。茶氨酸還是茶樹中含量最高的游離氨基酸，在茶樹的新梢芽葉中，70%左右的游離氨基酸是茶氨酸。近年對茶葉保健成分的研宄中，茶氨酸是一種比較引人注目的化合物，在它的許多生理作用被發(fā)現(xiàn)以后，如何制造、合成及提取茶氨酸也成了廣泛關(guān)注的研宄課題。
[0003]茶氨酸屬于酰胺類化合物，它的化學(xué)名為:N-乙基-γ -L-谷氨酰胺(N-ethyl-γ -L-glutamine)，分子式為:H00CCHNH2CH2CH2C0NHCH2CH3，分子量為 174.2。自然界存在的茶氨酸均為L型，純品為白色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)217-218 °C (分解)。極易溶于水，而不溶于無水乙醇和乙醚，且溶解性隨溫度升高而增大，具有焦糖的香味和類似味精的鮮爽味。經(jīng)6mol/L鹽酸水解后生成L-谷氨酸和乙胺，茚三酮反應(yīng)成紫色。
[0004]一、茶氨酸的功能與應(yīng)用 1.茶氨酸的功能
茶氨酸自發(fā)現(xiàn)以來，一直是被作為茶葉的主要品質(zhì)成分廣為研宄。近年來，茶氨酸具有的一些特殊生理功能不斷地被發(fā)現(xiàn)，從而成為茶葉功能性成分合成和提取、應(yīng)用的又一大熱點(diǎn)，研宄表明，茶氨酸具有許多有價(jià)值的藥用保健功效:
(1)降血壓作用；
(2)增強(qiáng)抗腫瘤藥物的療效；
(3)松弛神經(jīng)緊張、焦慮等作用；
(4)對腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用；
(5)促進(jìn)大腦功能作用；
(6)改善經(jīng)期綜合癥作用；
(7)減肥作用；
(8)抗疲勞作用；
(9)提高免疫力，防御病毒。
[0005]2.茶氨酸的應(yīng)用
2.1茶氨酸在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用
茶氨酸在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用主要集中在以下幾個(gè)方面:
O茶氨酸可以用作抗腫瘤藥物。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明茶氨酸對小鼠可轉(zhuǎn)移性腫瘤有延緩作用，對患白血病小鼠可延長其存活期。
[0006]2)茶氨酸可以用于降壓藥物。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明喂飼高劑量茶氨酸，人為升壓大鼠的收縮壓、舒張壓，均有明顯的下降。
[0007]3)茶氨酸可以用在安神鎮(zhèn)靜藥物中。此外茶氨酸現(xiàn)已作為鎮(zhèn)靜劑中的有效成分，對帕金森氏癥、老年性癡呆、傳導(dǎo)神經(jīng)功能紊亂等疾病起預(yù)防效果。
[0008]2.2茶氨酸在食品工業(yè)中的應(yīng)用
作為一種新興的食品添加劑，茶氨酸具有優(yōu)良的加工特性和穩(wěn)定性，可以廣泛應(yīng)用于點(diǎn)心類、糖果及果凍、飲料、口香糖等食品中。概括起來，茶氨酸主要應(yīng)用在如下領(lǐng)域:
I)可作為茶飲料的品質(zhì)改良劑，在茶飲料生產(chǎn)過程中添加一定量的茶氨酸，能明顯改善茶飲料的品質(zhì)和風(fēng)味。
[0009]2)可作為改善食品風(fēng)味的添加劑。研宄表明，茶氨酸可改善咖啡、可可、高麗參飲料、葡萄柚飲料、啤酒等的苦味，減輕葡萄酒的澀味，因此，可作為這些食品風(fēng)味的改良劑。并且，茶氨酸在通常的食品加工條件下(如殺菌、PH和加熱等)比較穩(wěn)定，所以應(yīng)用范圍很廣。目前日本已開發(fā)出添加茶氨酸的巧克力、果凍、布丁、口香糖、保健茶和各種清涼飲料。
[0010]3)可作為功能食品的添加劑。茶氨酸具有增強(qiáng)腦中α波的強(qiáng)度，使人產(chǎn)生輕松感和提高記憶力等作用，并已通過人體試驗(yàn)。因此，將來可作為功能性成分添加到食品中，開發(fā)出緩解神經(jīng)緊張和益智的功能食品。
[0011]二、茶氨酸的生產(chǎn)方法 1.化學(xué)合成法
茶氨酸化學(xué)合成法目前主要是將L-谷氨酸去氫成為吡咯烷酮羥酸(PCA)，然后加入純乙胺(99%，氣-液)反應(yīng)得到茶氨酸?；瘜W(xué)合成手段制備茶氨酸成本低、操作復(fù)雜、反應(yīng)條件苛刻?；瘜W(xué)合成制造的都是D L-型消旋體，需要進(jìn)行拆分才能得到L-型產(chǎn)品。
[0012]2.茶葉提取法
傳統(tǒng)的提取方法是:因茶葉中存在的游離氨基酸為水溶性，選用熱水浸提。用醋酸鉛沉淀去除茶湯中的蛋白質(zhì)、多酚類和部分色素。通H2S去除過剩的鉛，用氯仿萃取去除咖啡堿。茶湯中茶氨酸經(jīng)堿式碳酸銅成鹽后，過濾除去其它組分。茶氨酸銅鹽經(jīng)稀硫酸溶解、加入H2S和適量Ba (OH) 2抽濾去濾渣、濃縮、精制后得天然茶氨酸純品。但是此法收率較低，弓丨入雜質(zhì)重金屬離子Pb2+、Cu2+。
[0013]3.利用茶樹愈傷組織培養(yǎng)生產(chǎn)茶氨酸
茶樹愈傷組織培養(yǎng)法是以嫩茶葉作為外植體材料，用特殊培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，優(yōu)化培養(yǎng)條件如光照、溫度、培養(yǎng)基，添加適當(dāng)?shù)纳L因子，選擇合適的前體物質(zhì)可得到較好的生產(chǎn)效果。一般認(rèn)為當(dāng)培養(yǎng)基中乙胺的濃度為25mol/L時(shí)，茶葉愈傷組織的茶氨酸生物合成達(dá)到最大值，茶愈傷組織(干質(zhì)量)中茶氨酸的含量達(dá)200mg/g以上，占干重的20%左右。Furuya T等在改良MS培養(yǎng)基中，加入20mM的底物(初級(jí)胺，如2-氰乙胺、延胡索酸、鹽酸苯胺、鹽酸芐胺、鹽酸苯乙胺等)、溫度控制在25°C、黑暗中振蕩培養(yǎng)4-5周，可獲得較高的茶氨酸產(chǎn)量。該方法產(chǎn)量低，產(chǎn)品分離純化過程復(fù)雜及生產(chǎn)工藝的控制難度大等限制了該方法的工業(yè)化。
[0014]4.生物發(fā)酵酶法
隨著生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，利用微生物發(fā)酵來生產(chǎn)酶，進(jìn)而利用酶的提取物來進(jìn)行目的物的生產(chǎn)越來越被廣泛地應(yīng)用。與化學(xué)合成法相比，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)茶氨酸具有完全不同的特色。由于酶促反應(yīng)所具有的高度專一性，所以無需對α-氨基進(jìn)行乙胺基化。但是由于生物體內(nèi)合成茶氨酸需要ATP水解成ADP來提供能量，而ATP的獲得與再生要靠葡萄糖的降解來推動(dòng)。因此，茶氨酸的合成反應(yīng)必須與葡萄糖的降解反應(yīng)相偶聯(lián)。微生物發(fā)酵合成茶氨酸的反應(yīng)，實(shí)際上是運(yùn)用微生物中的谷氨酰胺酶在特殊的條件下(高乙胺濃度和特定的PH值)進(jìn)行的非特異反應(yīng)，而該酶在通常情況下對氨的親和力比乙胺大得多。
[0015]目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的可以催化茶氨酸合成的酶主要有3種:茶氨酸合成酶(Theaninesynthetase, EC6.3.1.6)、谷氨酰胺酶(L-Glutaminase，EC 3.5.1.2)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ -Glutamyltranspeptidase, γ-GGT)。其中，茶氨酸合成酶是茶葉中的生物合成酶，但一直未能將其基因克隆出來；其它兩種酶來自微生物，比較方便進(jìn)行利用。目前主要用于發(fā)酵生產(chǎn)L-茶氨酸的酶是γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶。
[0016]采用微生物發(fā)酵法可直接得到L-茶氨酸，可大量生產(chǎn)茶氨酸，適合工業(yè)化生產(chǎn)。但是目前酶法生產(chǎn)茶氨酸的方法主要是以谷氨酰胺、乙胺為前體，用微生物培養(yǎng)產(chǎn)γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶或谷氨酰胺酶，合成茶氨酸。
[0017]如中國專利《高效轉(zhuǎn)化谷氨酰胺合成L-茶氨酸的大腸桿菌菌株及其應(yīng)用》CN200910035096.4[P], 2010-02-10,此發(fā)明所說的高效轉(zhuǎn)化L-谷氨酰胺和乙胺的大腸桿菌，是大腸桿菌(Escherichia coli)南師一號(hào)CCTCC N0.M 209166。該菌株高產(chǎn)茶氨酸合成酶，高效轉(zhuǎn)化谷氨酰胺和乙胺為L-茶氨酸并在工業(yè)化生產(chǎn)過程中獲得成功；對谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化超過80%。(江蘇，南京師范大學(xué)，常州阿格羅生物科技有限公司.)。
[0018]如中國專利《固定化基因工程菌生物合成茶氨酸的方法》，CN200810162598.9 [P].2009-06-03，提供了一種固定化基因工程菌，命名為:大腸埃希氏菌Escherichia coli，在中國微生物菌種保藏中心的保藏號(hào)為:CGMCC N0.2714，通過克隆E.coli DH5a中γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GGT)基因構(gòu)建，含有重組質(zhì)粒pET32a_GGT，質(zhì)粒大小7563bp，GGT片段大小1743bp，具有氨芐青霉素抗性，異丙基硫代-β -D-半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，可以將谷氨酰胺轉(zhuǎn)化合成為L-茶氨酸(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研宄所.)。
[0019]上述這種以谷氨酰胺為底物的轉(zhuǎn)化法成本較高，工藝復(fù)雜，步驟較多，收率較低，導(dǎo)致成本較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種符合工業(yè)生產(chǎn)，工藝簡單，生產(chǎn)成本低，收率高，且產(chǎn)品純度高、質(zhì)量好的混合菌種微生物轉(zhuǎn)化法高效合成L-茶氨酸的方法。
[0021]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的所采取的技術(shù)方案為:
一種混合菌種微生物轉(zhuǎn)化法高效合成L-茶氨酸的方法，其特征在于采用黃色短桿菌和硝基還原假單胞菌進(jìn)行混合發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液升溫進(jìn)行菌體滅活處理，然后加入乙胺進(jìn)行合成轉(zhuǎn)化。
[0022]所述混合發(fā)酵是以葡萄糖為底物，輔以氮源和微量元素作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行的，首先將基礎(chǔ)培養(yǎng)基在115°C?12