一種快速檢測紡織品中白假絲酵母菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及紡織品微生物檢測領(lǐng)域，特別是一種快速檢測紡織品中白假絲酵母菌 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 傳統(tǒng)白假絲酵母菌的檢測通常為白假絲酵母菌培養(yǎng)，然后做芽管試驗(yàn)，糖發(fā)酵試 驗(yàn)等生化試驗(yàn)驗(yàn)證，主要包括以下步驟：
[0003] 1、增菌培養(yǎng)：取供試液10mL直接或處理后接種至適量（不少于100mL)的沙氏葡 萄糖肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h~72h;
[0004] 2、分離培養(yǎng)：取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng) 24h~48h(必要時(shí)延長至72h)。
[0005] 白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落呈乳白色偶見淡黃色，表面光 滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時(shí)間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有皺摺。若平板上無菌 落生長或生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出白色念珠菌；如平板上生 長的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選2個(gè)~3個(gè)菌落分別接種至念珠菌顯色 培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24h~48h(必要時(shí)延長至72h);若平板上無綠色或翠綠色的菌落生 長，判供試品未檢出白色念珠菌；若平板上生長的菌落為綠色或翠綠色，挑取相符或疑似的 菌落接種于1 %吐溫80玉米瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24h~48h。取培養(yǎng)物進(jìn)行染色，鏡檢及芽 管試驗(yàn)；
[0006] 3、芽管試驗(yàn)：挑取1%吐溫80玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清 的載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤的平皿內(nèi)，置35°C~37°C、lh~3h，置顯微鏡下觀察，可見 到由孢子長出短小芽管，若上述疑似菌為非革蘭陽性菌，顯微鏡未見厚膜孢子、假菌絲、芽 管，判供試品未檢出白色念珠菌；
[0007] 4、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：取18mm口徑的試管，放入倒置的15mm口徑的試管，棉塞封口后 滅菌待用，先把葡萄糖，蔗糖，麥芽糖配成糖發(fā)酵培養(yǎng)基，每取4mL裝入小試管中并接入 菌體一環(huán)，搖勻后倒置于大試管中，棉塞封口后26°C培養(yǎng)，其間觀察培養(yǎng)基顏色變化及是 否有氣體產(chǎn)生；
[0008] 5、碳源化合物的同化-液體實(shí)驗(yàn)：選用葡萄糖，蔗糖，麥芽糖，可溶性淀粉，甘 油，檸檬酸；把活化的菌接種于4mL無菌氮源液體培養(yǎng)基中，26°C培養(yǎng)2d，以消耗多余的 碳源；在15mm口徑無菌試管中每管加入4mL液體培養(yǎng)基；然后用無菌吸管把經(jīng)過饑餓培養(yǎng) 的菌懸液，滴入準(zhǔn)備好的試管內(nèi)，每管五滴，棉塞封口后26°C靜置培養(yǎng)2d，搖勻后觀察結(jié) 果，濁度顯增大者為陽性，反之則為陰性；
[0009] 上述的傳統(tǒng)方法檢測白假絲酵母菌，培養(yǎng)時(shí)間長，敏感性低，步驟繁瑣，容易導(dǎo)致 雜菌污染，影響最終結(jié)果的檢測，且均為定性的報(bào)告結(jié)果，而白假絲酵母菌為條件致病菌， 廣泛存在自然界中，對熱的抵抗力不強(qiáng)，加熱至60°c、lh后即可死亡，但對干燥、日光、紫外 線及化學(xué)制劑等抵抗力較強(qiáng)，當(dāng)機(jī)體免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制約作用 失調(diào)，則本菌大量繁殖并改變生長形式（芽生菌絲相）侵入細(xì)胞引起疾病，其感染劑量較 高，一般大于1〇5個(gè)真菌，所以對白假絲酵母菌的定性檢測對其致病性的指導(dǎo)作用非常小， 定量的檢測則更具意義。
[0010] 傳統(tǒng)的紡織品的樣品采集常用的有兩種：
[0011] 第一種涂抹法，這種方法最大優(yōu)點(diǎn)是不破壞樣品，適用于樣品質(zhì)地比較薄而密集， 細(xì)菌含量較高的樣品，但在實(shí)際運(yùn)用中，由于紡織品具有多孔結(jié)構(gòu)和吸水特性，而且紡織品 有一定的厚度，僅用表面涂抹取樣不能完全檢測到樣品受污染真正情況，當(dāng)遇到細(xì)菌含量 較低的樣品或質(zhì)地較厚實(shí)的樣品時(shí)，涂抹過程中會出現(xiàn)樣品采集不徹底，樣品不完全采集 的情況，易因檢出率低，引起假陰性結(jié)果，從而誤導(dǎo)檢測人員產(chǎn)生錯(cuò)誤判定；
[0012] 第二種剪碎20g稱量法，這種方法破壞了樣品，適用于細(xì)菌含量低的小面積紡織 品，但實(shí)際中紡織品種類千差萬別，面積大小、厚度不一，如果僅稱量20g作為檢樣，不具代 表性，如果樣品吸水性強(qiáng)，所制樣品不均質(zhì)，更易造成假陰性結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 針對現(xiàn)有紡織品中白假絲酵母菌檢測過程中所存在的問題，本發(fā)明的目的在于提 供一種紡織品中白假絲酵母菌采集、檢測新方法，克服現(xiàn)有紡織品中白假絲酵母菌檢測的 過程中存在的不足與缺陷。
[0014] 其解決問題的技術(shù)方案是：
[0015] 一種快速檢測紡織品中白假絲酵母菌的方法，包括以下步驟：
[0016] 步驟一：檢樣采集
[0017] 在送檢的紡織品四周和中間均勻布控5個(gè)~10個(gè)采樣點(diǎn)，用滅菌不銹鋼直尺測 量，每個(gè)采樣點(diǎn)按5cmX5cm(25cm2)面積范圍剪裁，每25cm2采樣面積為1份檢樣，如果被檢 樣品面積過大或過小，采樣面積可按比例擴(kuò)大或縮小；
[0018] 步驟二：樣液制備
[0019] 將采集好的5份~10份檢樣放入盛有200mL滅菌生理鹽水的全濾網(wǎng)無菌均質(zhì)袋 中，用拍擊式均質(zhì)器拍打lmin~2min，得到一個(gè)生理鹽水樣液，制成樣液作為原液，如果被 檢樣品大量吸水而導(dǎo)致不能吸出足夠樣液時(shí)，滅菌生理鹽水量可按每次l〇〇mL遞增，直至 能抽提有足夠100mL~120mL的測試樣液；每個(gè)樣液30min內(nèi)抽提檢測完畢；
[0020] 步驟三：樣液稀釋，過濾
[0021] 將步驟二制備的樣液稀釋后用濾膜過濾備用，每張濾膜過濾100mL樣液；應(yīng)根據(jù) 樣品污染情況確定樣液的稀釋倍數(shù)，以濾過一張無菌濾膜后能產(chǎn)生小于100個(gè)菌落為宜， 如果樣品污染嚴(yán)重，可將樣液原液稀釋10倍，取l〇〇mL稀釋液過濾；
[0022] 步驟四：白假絲酵母菌檢測培養(yǎng)
[0023] 用無齒滅菌鑷子夾取孔徑為0.45ym微孔滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙面向上， 貼放在已滅菌的濾床上，固定好濾器，將過濾后的樣液注入濾器中，打開濾器閥門，在負(fù) 0. 5X105Pa下抽濾，樣液濾完后，再抽氣約5s，關(guān)上濾器閥門，取下濾器，用滅菌鑷子夾取濾 膜邊緣部分，移放在孟加拉紅培養(yǎng)基平板上，濾膜截留細(xì)菌面向上，濾膜應(yīng)與培養(yǎng)基完全貼 緊，兩者間不留氣泡，然后將孟加拉紅平板放入28°C±1°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h~48h，白假絲 酵母菌在孟家拉紅培養(yǎng)基養(yǎng)出的菌落具有以下特征：淺粉色大的形狀不規(guī)則菌落，中心凹 陷，邊緣色淺不整齊，菌落表面干燥，有的菌落有菌絲；釀酒酵母菌在孟家拉紅培養(yǎng)基上培 養(yǎng)出的菌落具有以下特征：無菌絲，邊緣整齊，淺粉色，中心凹陷的大菌落；每個(gè)平板上挑 取5個(gè)可疑菌落，用微生物快速檢測系統(tǒng)（MALDIBioTyper)進(jìn)行驗(yàn)證；
[0024] 步驟五：微生物快速檢測系統(tǒng)（MALDIBioTyper)標(biāo)準(zhǔn)品溶液和基質(zhì)溶液的制備
[0025] 使用微生物快速檢測系統(tǒng)（MALDIBioTyper)專用的標(biāo)準(zhǔn)品BacterialTest Standard(BTS)加入標(biāo)準(zhǔn)溶劑50 %乙腈+47. 5 %水+2. 5 %三氟乙酸50y1，使用移液器 反復(fù)吹吸的方式，溶解BTS粉末（不能劇烈震蕩溶解）；室溫放置5分鐘，之后重復(fù)吹吸， 13000rpm離心2min，分裝，-20°C冰箱保存，禁止反復(fù)凍融溶解好的BTS，每次使用取一管；
[0026] 使用微生物快速檢測系統(tǒng)（MALDIBioTyper)專