丁二醇類的制造方法、用于制造丁二醇類的微生物的制作方法以及微生物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及丁二醇類的制造方法、用于制造丁二醇類的微生物的制作方法以及微 生物。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，從化石資源枯竭及全球變暖對(duì)策等的觀點(diǎn)，以可再生資源為原料的化合 物制造工藝受到關(guān)注。尤其是，以生物質(zhì)作為原料并利用生物化學(xué)工藝來制造各種聚合物 原料化合物或化學(xué)品原料化合物的技術(shù)，即所謂的生物煉制被廣泛研宄。
[0003] 作為被期待進(jìn)行生物質(zhì)原料轉(zhuǎn)化的化合物，可舉出丁二醇類。例如，1，3 丁二醇被 用作溶劑，另外，1，4 丁二醇廣泛用于精密有機(jī)化學(xué)品的合成原料、聚酯及工程塑料的單體 單位等，其市場(chǎng)規(guī)模大。因此，對(duì)于以生物質(zhì)等可再生資源為原料并利用生物化學(xué)工藝來高 效制造丁二醇類的制造方法的要求在提高。
[0004] 作為利用生物化學(xué)工藝來制造丁二醇類的制造方法，例如可舉出專利文獻(xiàn)1和2 以及非專利文獻(xiàn)1記載的方法。
[0005] 專利文獻(xiàn)1 :(日本）專利第4380704號(hào)公報(bào)
[0006] 專利文獻(xiàn)2 :國(guó)際公布2008/115840號(hào)公報(bào)
[0007]非專利文獻(xiàn)I:HarryYimetal.，Metabolicengineeringof Escherichiacolifordirectproductionof1，4-butanediol，NatureChemical Biology，7, 445-452 (2011).

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]〈本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題〉
[0009] 然而，專利文獻(xiàn)1和2及非專利文獻(xiàn)1記載的方法的工藝復(fù)雜。
[0010] 針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供一種較經(jīng)濟(jì)的丁二醇類的制造方法。
[0011] 〈用于解決技術(shù)問題的方案〉
[0012] 本發(fā)明包括以下內(nèi)容。
[0013] [1] 一種丁二醇類的制造方法，其使用微生物及/或其培養(yǎng)物、經(jīng)由3-羥基丁酰 CoA并利用?；鵆oA還原酶的酶反應(yīng)來制造丁二醇，其特征在于所述微生物的酰基CoA水解 酶（EC3. 1. 2_)的活性缺失或降低。
[0014] [2]如[1]所述的丁二醇類的制造方法，其中，所述?；鵆oA水解酶是被分類為 EC3.L2. 2或EC3.L2. 20的酰基CoA水解酶。
[0015] [3]如[1]所述的丁二醇類的制造方法，其中，所述微生物包含0-酮硫解酶 (EC2. 3. 1. 9)的編碼基因、3-羥基丁酰CoA脫氫酶（EC1.I. 1. 35)的編碼基因以及?；鵆oA 還原酶（EC1. 2. 1. 10)的編碼基因。
[0016] [4]如[3]所述的丁二醇類的制造方法，其中，所述微生物包含烯酰CoA水合酶 (EC4. 2.I. 17)的編碼基因、乙烯乙酰CoA異構(gòu)酶（EC5. 3. 3. 3)的編碼基因以及4-羥基丁酰CoA脫水酶（EC4. 2. 1. 120)的編碼基因。
[0017] [5]如[1]所述的丁二醇類的制造方法，其中，所述微生物是大腸桿菌、酵母、棒狀 桿菌或梭菌屬細(xì)菌。
[0018] [6]如[5]所述的丁二醇類的制造方法，其中，所述微生物是?；鵆oA硫酯酶II基 因（tesB)的CDS區(qū)域缺失的大腸桿菌。
[0019] [7] -種用于制造丁二醇類的微生物的制作方法，其特征在于包括使微生物的酰 基CoA水解酶（EC3. 1. 2. _)的活性缺失或降低的工序。
[0020] [8]如[7]所述的用于制造丁二醇類的微生物的制作方法，其中，所述?；鵆oA水 解酶是被分類為EC3. 1. 2. 2或EC3. 1. 2. 20的酰基CoA水解酶。
[0021] [9] 一種微生物，其包含0 -酮硫解酶（EC2. 3. 1. 9)的編碼基因，3-羥基丁酰CoA 脫氫酶（EC1.I. 1. 35)的編碼基因以及?；鵆oA還原酶（EC1. 2. 1. 10)的編碼基因，并且酰 基CoA水解酶（EC3. 1. 2.-)的活性缺失或降低。
[0022] [10]如[9]所述的微生物，其中，所述?；鵆oA水解酶是被分類為EC3. 1.2.2或 EC3. 1. 2. 20的?；鵆oA水解酶。
[0023] [11]如[9]所述的微生物，其中還包括烯酰CoA水合酶（EC4. 2. 1. 17)的編 碼基因、乙烯乙酰CoA異構(gòu)酶（EC5. 3. 3. 3)的編碼基因以及4-羥基丁酰CoA脫水酶 (EC4. 2. 1. 120)的編碼基因。
[0024] [12]如[9]所述的微生物，該微生物是是大腸桿菌、酵母、棒狀桿菌或梭菌屬細(xì) 菌。
[0025]〈發(fā)明的果〉
[0026] 本發(fā)明提供一種有選擇性的且經(jīng)濟(jì)的丁二醇類的制造方法。
【附圖說明】
[0027] 圖1是本實(shí)施方式的丁二醇類的制造方法的酶系的一個(gè)例子。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 以下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。在本說明書中，"CoA"表示"輔酶A"。另外，若無 特別記載，" ％ "表示"質(zhì)量％ "。"ppm"是質(zhì)量基準(zhǔn)。
[0029] 本實(shí)施方式提供一種使用微生物、經(jīng)由3-羥基丁酰CoA并包含由?；鵆oA還原酶 催化的還原工序的丁二醇類制造方法。為了提高丁二醇類的生產(chǎn)性，發(fā)明者們進(jìn)行了各種 研宄。具體而言，細(xì)查了宿主微生物原有酶系中存在的可對(duì)丁二醇類生產(chǎn)性帶來大的影響 (副反應(yīng)）的酶系。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，宿主來源的酶引起的由3-羥基丁酰CoA生成3-羥基丁酸 的反應(yīng)，屬其副反應(yīng)酶系之一。即，從3-羥基丁酰CoA變成3-羥基丁酸的水解反應(yīng)是由酰 基CoA還原酶催化的還原工序，換言之，最終會(huì)對(duì)丁二醇類的生成造成很大影響。
[0030] 基于以上見解，發(fā)明者們還發(fā)現(xiàn)，通過使該生化制造方法中使用的宿主菌所具有 的特定酰基CoA水解酶（EC3. 1. 2.-)的活性缺失或降低，能夠抑制由3-羥基丁酰變成3-羥 基丁酸的水解反應(yīng)，其結(jié)果能夠提高丁二醇類的生產(chǎn)量。
[0031 ] 以下，對(duì)于本實(shí)施方式中使用的微生物的特征、微生物的制作方法、微生物的使用 方法（即、丁二醇類的制造方法）以及制造出的丁二醇類的取得方法等進(jìn)行說明。
[0032](宿主微生物）
[0033] 本實(shí)施方式中使用的宿主微生物是?；鵆oA水解酶的活性缺失或降低的微生物。 通過將此類微生物用為制造丁二醇類的宿主，在經(jīng)由3-羥基丁酰CoA并包含由?；鵆oA還 原酶催化的還原工序的丁二醇類制造方法中，能夠抑制3-羥基丁酰CoA被?；鵆oA水解酶 水解成3-羥基丁酸，其結(jié)果能夠提高丁二醇類的生產(chǎn)性。
[0034] 作為活性缺失或降低的對(duì)象的"酰基CoA水解酶"，如果是具有分解3-羥基丁酰 CoA的活性的酶，則并無特別限定，但具體可舉出屬于EC3. 1. 2. 2的?；鵆oA水解酶、屬于 EC3. 1. 2. 20的?；鵆oA水解酶以及這些的同源物。這些酶亦通稱酰基CoA硫酯酶、硫酯酶、 硫酯酶II等，本發(fā)明中的"酰基CoA水解酶"包括這些酶。
[0035] 另外，本說明書中所說的活性"缺失或降低"是指，相對(duì)于作為改變對(duì)象的親代菌 株而言，對(duì)象?；鵆oA水解酶的活性降低至二分之一以下的情況。通過這樣的缺失或降低， 能夠避免3-羥基丁酰CoA的分解，從而可實(shí)質(zhì)上提高丁二醇類的生產(chǎn)性。需要說明的是，在 使用任一種菌株的實(shí)施方式中，均優(yōu)選"?；鵆oA水解酶"的活性相比于大腸桿菌JM109菌 株降低至1/2以下的情況。能夠通過以下方式來確認(rèn)本實(shí)施方式中的"缺失或降低"。例如， 由生成3-羥基丁酰CoA的一系列酶的編碼基因，轉(zhuǎn)化該宿主微生物，并在包含作為這些酶 反應(yīng)的基質(zhì)的，例如葡萄糖等適當(dāng)?shù)奶荚吹呐囵B(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。生成的3-羥基丁酰CoA因存 在?；鵆oA水解酶而被水解，成為3-羥基丁酸被排出到菌體外。通過高速液體層析（HPLC) 等一般所知的方法對(duì)該3-羥基丁酸進(jìn)行定量，從而能夠評(píng)價(jià)?；鵆oA水解酶的"缺失或降 低"。
[0036] 在本實(shí)施方式中，作為改變對(duì)象的親代菌株所使用的微生物，例如是能夠?qū)胂?述各種基因的宿主微生物，如果能夠應(yīng)用基因重組技術(shù)，并表達(dá)作為活性缺失或降低對(duì)象 的酰基CoA水解酶，則對(duì)該微生物無特別限定。
[0037] 作為本實(shí)施方式中可使用的宿主微生物的具體例，從產(chǎn)業(yè)利