留灌流液I，去除灌流液I中膠原酶活性的抑制劑 EGTA等成分，為酶消化做準(zhǔn)備。
[0066] 最后，以500-1100mL/min的速度將37°C加氧的含有膠原酶的灌流液III灌入肝臟， 灌入肝臟的灌流液III從肝上下腔靜脈處溢出，保存在裝有肝臟的裝肝臟容器8中，開(kāi)啟回 流泵9以與灌流泵4相同的速度將灌流液III抽回灌流液III儲(chǔ)存容器3中，形成勻速循環(huán)灌 流肝臟，25-40分鐘后，直至肝包膜與肝細(xì)胞分離，結(jié)束灌流。灌流液III流入廢液容器10內(nèi)， 棄去。此為第三步肝灌流，主要通過(guò)向肝內(nèi)循環(huán)灌注膠原酶，消化分解肝細(xì)胞之間的纖維連 接，分尚肝細(xì)胞。
[0067] 之后將裝有肝臟的裝肝臟容器8從灌流裝置中取出，移入超凈工作臺(tái)中，進(jìn)入 后續(xù)的肝細(xì)胞懸液收集及洗滌過(guò)程。所述肝細(xì)胞洗滌的過(guò)程為：首先，將預(yù)冷至4°C的 Williams'MediumE洗滌培養(yǎng)基，300-1000mL加入無(wú)菌盆中，用手術(shù)剪劃開(kāi)肝包膜，分離未 消化的肝組織和結(jié)締組織，收集肝細(xì)胞懸液。上述肝細(xì)胞懸液經(jīng)四層脫脂紗布過(guò)濾后，4°C 條件下，離心力50-55Xg離心10分鐘。之后，棄去離心上清液，用4°C的Williams'Medium E洗滌培養(yǎng)基重懸沉淀的肝細(xì)胞，4°C條件下，離心力50-55Xg離心10分鐘。將上述過(guò)程重 復(fù)一次。最后，棄去離心上清液，沉淀肝細(xì)胞用無(wú)血清肝細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為 2-5X107個(gè)每毫升，置冰浴中備用。
[0068] 以上所述的灌流液I每升含有：8. 3克氯化鈉，0? 5克氯化鉀，2. 4克HEPES，3-6g NAC，0. 9-1.lgEGTA，余量為去離子水；
[0069] 灌流液II每升含有：8. 3克氯化鈉，0. 5克氯化鉀，2. 4克HEPES，余量為去離子水；
[0070] 灌流液III每升含有：3. 9克氯化鈉，0. 5克氯化鉀，24克HEPES，0. 07克二水氯化鈣 (CaCl2 ? 2H20)，4克白蛋白，68-130PZ活性單位膠原酶，余量為去離子水。
[0071] Williams' Medium E 洗滌培養(yǎng)基每升中含有：9. 5-10. 8 克 Williams' Medium E 粉 末，2. 2克碳酸氫鈉，2. 6克HEPES，0. lg鏈霉素，100000單位青霉素，余量為去離子水。
[0072] 實(shí)施例2使用本發(fā)明體外肝灌流裝置進(jìn)行原代肝細(xì)胞分離制備的方法
[0073] -、試驗(yàn)試劑
[0074] 灌流液I、灌流液II、灌流液III、肝細(xì)胞洗滌液；
[0075] 各自的制備方法如下：
[0076] 1.灌流液I :以配制1升試劑為例：
[0077] (1)取如下成分：氯化鈉8. 3克、氯化鉀0. 5克、HEPES 2. 4克、NAC 4克、EGTA 0. 95 克；
[0078] (2)將上述成分混合，溶于去離子水，室溫下攪拌10分鐘，使其充分溶解，定容至 1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,用0. 2微米濾膜過(guò)濾除菌，常溫保存即可。使用時(shí)，預(yù)熱至37°C。
[0079] 2.灌流液II :以配制1升試劑為例：
[0080] (1)取如下成分：氯化鈉8. 3克、氯化鉀0. 5克、HEPES 2. 4克；
[0081] (2)將上述成分混合，溶于去離子水，室溫下攪拌10分鐘，使其充分溶解，定容至 1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,用0. 2微米濾膜過(guò)濾除菌，常溫保存即可。使用時(shí)，裝入灌流液II儲(chǔ)存容 器2中，預(yù)熱至37°C。
[0082] 3.灌流液III :以配制1升試劑為例：
[0083] (1)取如下成分：氯化鈉3. 9克、氯化鉀0? 5克、HEPES 24克、二水氯化鈣 (CaCl2 ? 2H20)0. 07克、白蛋白4克、膠原酶SERVA NB8(lmg酶里面是1. 08個(gè)WUnsch單 位）200毫克（即216WUnsch單位）；
[0084] (2)將上述成分混合，溶于去離子水，室溫下攪拌10分鐘，使其充分溶解，定容至 1L，調(diào)節(jié)pH至7. 6,用0. 2微米濾膜過(guò)濾除菌，使用前15分鐘配置，使用時(shí)，裝入灌流液III儲(chǔ) 存容器3中，預(yù)熱至37°C。
[0085] 4.肝細(xì)胞洗滌液：以配制1升試劑為例：
[0086] (1)取如下成分：Williams'Medium E 粉末 9. 5 克、碳酸氫鈉 2. 2 克、HEPES 2. 6 克、 鏈霉素〇. 1克、青霉素100000單位；
[0087] (2)將上述成分混合，溶于去離子水，室溫下攪拌10分鐘，使其充分溶解，定容至 1L，調(diào)節(jié)pH至7. 3,用0. 2微米濾膜過(guò)濾除菌，4°C保存和使用。
[0088] 二、試驗(yàn)方法
[0089] 獲取正常巴馬豬完整肝臟，以全肝臟重300克為例分離制備原代豬肝細(xì)胞。分別 將灌流液I裝入灌流液I儲(chǔ)存容器1中，將灌流液II裝入灌流液II儲(chǔ)存容器2中，將灌流液 III裝入灌流液III儲(chǔ)存容器3中。所述預(yù)熱均通過(guò)熱交換器5預(yù)熱。
[0090] a、肝臟的體外灌流
[0091] 將摘取的完整肝臟，置于裝肝臟容器8中，采用內(nèi)徑6_軟管經(jīng)門靜脈插管，將過(guò) 濾滅菌、預(yù)熱至37°C 4000mL灌流液I，經(jīng)灌流泵4以400mL/min速度灌流10分鐘，棄去灌 流液；接著用過(guò)濾滅菌、預(yù)熱至37°C 800mL灌流液II，以400mL/min速度灌流2分鐘，棄去 灌流液；之后將過(guò)濾滅菌、預(yù)熱至37°C的2000mL灌流液III，以500mL/min速度循環(huán)灌流30 分鐘，。以上灌流過(guò)程中，所有灌流液都經(jīng)過(guò)氧合器6的加氧過(guò)程，保證灌流液中溶解氧分 壓為 200mmHg。
[0092] b、分離肝細(xì)胞
[0093] 棄去灌流液，將肝臟轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌盆中，倒入600mL預(yù)冷至4°C的肝細(xì)胞洗滌 液，劃開(kāi)肝包膜，去掉未消化的肝組織和結(jié)締組織，收集肝細(xì)胞懸液。上述肝細(xì)胞懸液經(jīng) 四層脫脂紗布過(guò)濾后，平均分裝于兩個(gè)容積為750mL的無(wú)菌離心瓶中，4°C條件下，離心力 50Xg離心10分鐘。棄去離心上清液，再重復(fù)向每個(gè)離心瓶中加入4°C的肝細(xì)胞洗滌液 500mL重懸沉淀的肝細(xì)胞，4°C條件下，離心力50Xg離心10分鐘。棄去離心上清液，再重 復(fù)向每個(gè)離心瓶中加入4°C的肝細(xì)胞洗滌液500mL重懸沉淀的肝細(xì)胞，4°C條件下，離心力 50Xg離心10分鐘。棄去上清液，收集沉淀，即為分離得到的肝細(xì)胞。
[0094] 三、檢測(cè)方法
[0095] 沉淀肝細(xì)胞稱重后，用500mL預(yù)冷至4°C的無(wú)血清肝細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，計(jì)算第一 次稀釋倍數(shù)，然后取出10mL肝細(xì)胞懸液，進(jìn)一步用無(wú)血清肝細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至400倍，對(duì) 稀釋至400倍的肝細(xì)胞在進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡下計(jì)數(shù)，細(xì)胞核藍(lán)染 為死細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞活率，根據(jù)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)計(jì)算細(xì)胞純度。同時(shí)通過(guò)顆粒計(jì)數(shù)儀 (Multisizer 3 Beckman Coulter counter)測(cè)定細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞濃度。剩余肝細(xì)胞懸液置 于冰浴中備用，并最后根據(jù)所需細(xì)胞的用途調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)。
[0096] 四、試驗(yàn)結(jié)果
[0097] 本發(fā)明制備的肝細(xì)胞結(jié)果如下表所示：
[0098]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種體外肝灌流裝置，其特征在于：包括灌流液儲(chǔ)存容器組、四通管、灌流泵、熱交 換系統(tǒng)、氧合器、去泡器、灌流導(dǎo)管、三通管和回流泵； 所述灌流液儲(chǔ)存容器組包括容器A、容器B和容器C，所述容器A、容器B、容器C均設(shè)有 進(jìn)液口和帶有截止閥的出液口，所述容器C還設(shè)有回流口； 所述灌流泵、熱交換器、氧合器、去泡器、灌流導(dǎo)管和回流泵均設(shè)有進(jìn)液口和出液口； 所述四