在線工業(yè)魯棒化調控細胞狀態(tài)生產抗IgE單抗的裝置與方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物工程領域中可在線調節(jié)和控制細胞狀態(tài)生產抗IgE單克隆抗體的裝置與方法，尤其涉及一種可在線工業(yè)魯棒化(industrially robust)連續(xù)監(jiān)控、連續(xù)灌注生物反應器及培養(yǎng)瓶/袋系統(tǒng)的細胞培養(yǎng)環(huán)境中各項理生化指標，并可直接在線調節(jié)和控制細胞狀態(tài)的細胞培養(yǎng)、擴增和制備抗IgE單克隆抗體的裝置和方法。
【背景技術】
[0002]支氣管哮喘(以下簡稱哮喘)是由多種細胞包括氣道炎性細胞、結構細胞(如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞及氣道上皮細胞等)和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。哮喘是常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，全球大約有3億哮喘患者，我國哮喘患者大約有3000萬。
[0003]近年來，其患病率及死亡率呈上升趨勢，已成為嚴重的社會衛(wèi)生問題并引起世界各國的高度重視。隨著對哮喘發(fā)病機制研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)血清IgE水平和特異性IgE水平的增高是哮喘的主要特征,也是引起哮喘發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)之一。
[0004]IgE是介導I型變態(tài)反應的主要免疫球蛋白，在嗜堿性粒細胞、肥大細胞和樹突狀細胞上存在著高親和力的IgE Fe受體(FceR I)，而在嗜酸性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和血小板上均存在低親和力的IgE Fe受體(FceR II，即⑶23)。當患者首次吸入變應原，機體通過T淋巴細胞的傳遞，由B淋巴細胞合成特異性IgE。IgE能結合于肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的FceR I，也能結合于嗜酸性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等表面的FceR II。當機體再次吸入變應原時,可與結合于FceR I上的IgE形成抗原抗體復合物，使FceR I交聯(lián)，合成并釋放組胺、白三烯等炎癥介質。只需交聯(lián)15%?20%的FceR I即可引起肥大細胞/嗜堿性粒細胞大量釋放炎癥介質，從而導致平滑肌收縮、黏液分泌增加、血管通透性增高和炎性細胞浸潤。炎性細胞在上述炎癥介質的作用下又可分泌多種介質，使氣道病變加重，炎性細胞浸潤增加，導致哮喘病變進展。哮喘患者對變應原刺激可產生速發(fā)型和遲發(fā)型反應。速發(fā)型反應以氣道血管擴張、水腫及支氣管收縮為特點；遲發(fā)型反應以持續(xù)的氣道炎癥反應，包括嗜酸性粒細胞、單核細胞和中性粒細胞的浸潤為特點。哮喘速發(fā)或遲發(fā)型反應均與IgE有關，IgE不僅激活肥大細胞和嗜堿性粒細胞，而且激活樹突狀細胞及巨噬細胞等抗原遞呈細胞HJ。由此可見，在哮喘免疫反應的過程中，IgE起著關鍵作用。
[0005]奧馬珠單抗為重組人源化IgG單克隆抗體(以下簡稱單抗)，分子量約為149kD。以人IgE免疫小鼠，然后自小鼠脾臟分離B淋巴細胞，并與骨髓瘤細胞融合，獲得雜交瘤細胞，通過雜交瘤技術即可獲得抗IgE單抗。奧馬珠單抗同時解決了鼠抗IgE單抗用于人體可能引起過敏反應等問題，其去除了決定抗原性的鼠抗IgE單抗恒定區(qū)，僅保留與IgE特異性結合的互補決定區(qū)，將后者插入人IgG。結構框架，構建成重組人源化抗IgE單抗，因此能有效避免過敏反應的發(fā)生。
[0006]奧馬珠單抗具有一系列特殊的結合特性，其治療作用的發(fā)揮取決于其特殊的結合特性哺J:①其和IgE的結合具有很高的親和力和特異性。②其能和表達IgE的B淋巴細胞膜表面IgE(mlgE)結合，包括B淋巴母細胞和記憶B淋巴細胞，因此，其本身可能對體液免疫有一定的抑制作用。③如果IgE已與FceR I結合，那么本品不能再與之結合，因此也就不會引起受體交聯(lián)，激活相應細胞釋放介質。這是抗IgE治療安全性的一個重要保證。也SP，奧馬珠單抗主要和游離的IgE結合，這是其重要的作用特點。④如果IgE已與FceR II相結合,那么本品也不能再與之結合。⑤抗IgE的抗原表位位于￡鏈的CH3區(qū)域,與FceR I和FceR II的結合位點重疊或相鄰。
[0007]本品具有多重免疫藥理作用，其不僅是化學阻斷劑，還具有潛在的多重免疫調節(jié)功能。其已知和潛在的藥理作用有①能和血液及組織間液中的游離IgE結合，中和并阻斷IgE和FceR I和FceRII的結合。②游離IgE濃度接近O時能引起嗜堿性粒細胞和肥大細胞表面的FceR I表達下調，從而導致細胞對過敏原刺激的無反應性。⑨IgE和本品形成的復合物能快速積聚至IgE基礎值10倍以上，因而對新進入的過敏原分子而言具有清道夫作用。④本品能和表達IgE的B淋巴細胞結合并對其有潛在的下調作用。⑤過敏原不再傳遞至IgE優(yōu)先的⑶23途徑。
[0008]根據(jù)檢索，在中國專利CN101111265A“Xolair/抗IgE單克隆抗體/E25與免疫抑制劑的協(xié)同組合”中，權利人提供了包含抗IgE抗體和至少一種其他免疫抑制劑和任選的至少一種可藥用載體的藥物組合物，其中在每種情況下，所述活性成分以游離形式或可藥用鹽的形式存在；用于同時、分離或順序使用。但是對于抗IgE單克隆抗體抗體的生產方法沒有任何涉及。
[0009]就抗IgE單克隆抗體的產業(yè)化工藝而言，現(xiàn)代動物細胞生物反應器培養(yǎng)表達技術是上述產品的關鍵核心技術，該技術工藝復雜、難度大。這些先進的重組蛋白生產技術掌握在國外少數(shù)制藥公司手中，幫助這些跨國公司攫取高額利潤。而我國比世界先進技術水平相差懸殊，是牽扯到一系列技術的整體性工業(yè)的差距。因此，我們不僅需要快速追趕，縮小差距，更需要加快技術研發(fā)，在相關領域取得跨越式發(fā)展，形成真正具有自主知識產權的抗IgE單克隆抗體生產的核心關鍵技術。
[0010]目前，重組抗IgE單克隆抗體的生產表達方法通常為采用批培養(yǎng)，分批補料培養(yǎng)等。這些重組蛋白生產工藝雖然已經被放大至1000L以上，但是工藝本身存在如下缺點:I)培養(yǎng)，表達過程的參數(shù)控制較少，不能完全或只能部分程度的控制培養(yǎng)環(huán)境的理化條件如溫度，pH, CO2和O2濃度，營養(yǎng)物質濃度等；2)即使通過反應器對理、生、化條件進行精確控制，但這種控制方法仍然缺乏對細胞狀態(tài)本身的精確調節(jié)和控制。處于生長和蛋白過程中的細胞狀態(tài)可以極大地影響最終表達的重組蛋白質量(如蛋白質的糖基化水平，蛋白二級、三級結構的正確形成)，而細胞狀態(tài)并不僅僅是通過上述理、生、化等參數(shù)對細胞的影響所能決定的，對于抗IgE單克隆抗體這樣的蛋白來說，生產獲得的蛋白活性更加是遠遠比單純的蛋白質量重要；3)批次培養(yǎng)獲得的細胞的重復性較低，且極大地受到不同實驗和生產技術人員個人操作的影響，在試驗和生產中會出現(xiàn)較大的批次間差異(batch to batchvariat1n)，這也是目前藥物品質控制和監(jiān)管領域的難題之一。因此，一種具有簡便可靠性的(robust)可大規(guī)?；?scalable)應用于工業(yè)化(industrial)抗IgE單克隆抗體是目前表達工藝(process development)研究領域的瓶頸。
[0011]此外，對于傳統(tǒng)工藝用細胞狀態(tài)“好”與“壞”來描述細胞是一種口語化的表達，而“延遲期”，“對數(shù)生長期”和“平臺期”等言語也是一個較為籠統(tǒng)的概念，不夠精確和準確。據(jù)公開報導和本公司研究部門的研究結果，細胞生長的狀態(tài)與整個群體的細胞周期分布具有一定的相關性。按照細胞在分裂過程中表現(xiàn)出的顯著性差異的行為，細胞周期可以大致分為三個階段(圖1 (圖片來源于:www.newearthb1med.0rg)):gaplphase (Glphase,Gl期)是一個細胞周期的起始階段，在這個階段，細胞內部進行相關蛋白質的合成等行為，細胞體積和基因組不產生任何變化，隨后，細胞會根據(jù)自身所處的環(huán)境來判斷是否跨越過限制點(restrict1n point),進入 DNA 合成期(DNA synthesis phase, S phase, S 期)，在S期，細胞主要進行自身基因組DNA的合成復制，復制完畢后，細胞成為2倍體，即基因組翻倍，隨后細胞進入有絲分裂期(gap2/mitotic phase, G2/M phase, G2/M期),在此時期,細胞完成有絲分裂，得到兩個相同的子細胞，完成了一個細胞周期。當細胞所處環(huán)境不佳不利于細胞生長時，細胞無法跨過限制點，從而跳出細胞周期，進入一個額外的沉默期(restingphase, GOphase),成為不分裂細胞。根據(jù)細胞在不同周期的細胞行為，通過細胞核染色試劑檢測細胞核的DNA含量，配合流式細胞儀即可分辨單個細胞所處的細胞周期并繪制整個群體的細胞周期分布圖。對于正常培養(yǎng)過程中的細胞而言，細胞整體是一個異步培養(yǎng)體系(asynchronous culture),即在培養(yǎng)過程