菌水沖洗3次，然后 切成的小段放在含有鏈霉素的培養(yǎng)基中，最后一次無(wú)菌水作對(duì)照。3d后每天檢查 并挑取菌株并純化，直至2周。
[0043] 將分離到的菌株在PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3-7d，接種真菌菌絲、或者利用通體結(jié)香 技術(shù)輸入發(fā)酵液、除菌濾液，含濾液中的活性成分的提取液對(duì)白木香進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)有一種 菌株接種2個(gè)月后木質(zhì)部沉香層輪廓清晰可見(jiàn)（圖1中A)，圖1A為硬孔菌（R. vinctus) ASAF02促進(jìn)結(jié)香效果圖（A1打孔處A2距離孔口 50cm處），將該菌株命名為硬孔菌 (R. vinctus) ASAF02。將這株能結(jié)香的菌株硬孔菌（R. vinctus) ASAF02在培養(yǎng)基上培養(yǎng)觀 察，菌落為圓形、白色、勻質(zhì)狀，邊緣整齊（圖1中B)。由于該菌株不產(chǎn)孢，采用分子方法鑒 定，提取 ASAF002 菌株 DNA，以 ITS1 (SEQUENCE NO. 1 :5' -TCCGATGGTGAACCTGCGG-3 ')和 ITS4 (SEQUENCE NO. 2 ：
[0044] 5 ' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ')為引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增進(jìn)行測(cè) 序，測(cè)序獲得620bp的ITS序列，堿基序列如序列表中SEQUENCE NO. 3所示。將獲得的 序列在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示其序列與R. vinctus (Accession N〇.HQ400710 JQ717317)同源性達(dá)99%，通過(guò)形態(tài)特征和分子特征將其鑒定為硬孔菌 (R. vinctus)ASAF02。
[0045] 硬孔菌（R. vinctus) ASAF02已于2014年9月9號(hào)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管 理委員會(huì)普通微生物中心（簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為：中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)， 中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所），保藏號(hào)為：CGMCC NO. 9594。
[0046] 實(shí)施例2硬孔菌（R. vinctus) ASAF02菌株生長(zhǎng)條件檢測(cè)。
[0047] 將硬孔菌（R. vinctus) ASAF02的菌絲接種于含有固體PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中心， 在分別設(shè)置為10 °C、15 °C、20 °C、25 °C、28 °C、30 °C、35 °C的恒溫箱中培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硬孔菌 (R. vinctus)ASAF02在15°C至35°C條件均能生長(zhǎng)，但30°C最適合生長(zhǎng)。用0. lmol/L HCL 和0. lmol/L NaOH調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH值，制成PH值分別為3、4、5、6、7、8、9、10、11的液 體PDA培養(yǎng)基，將菌絲接種置于不同pH值的液體PDA培養(yǎng)基中，在30°C 200轉(zhuǎn)/分搖床培 養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株在PH3至PH11均能生長(zhǎng)，最適pH值為7。
[0048] 實(shí)施例3硬孔菌（R. vinctus) ASAF02促進(jìn)沉香產(chǎn)生效果驗(yàn)證
[0049] 將硬孔菌（R. vinctus)ASAF02菌株培養(yǎng)3-7d，得到菌株菌絲、發(fā)酵液，除菌濾液， 根據(jù)樹(shù)的大小按不同的劑量接種、鉆洞或者利用通體結(jié)香技術(shù)將含菌體的發(fā)酵液，發(fā)酵液 除去菌體的濾液接種白木香促進(jìn)結(jié)香，具體接種方法如下：
[0050] 1、接種材料的獲得：硬孔菌（R. vinctus) ASAF02菌株用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的菌 絲，即為接種菌絲1，可制成粉劑或膏劑。菌絲接種至PDA液體培養(yǎng)基中，在30°C 200轉(zhuǎn)/ 分搖培3-7d，得到培養(yǎng)液，即為菌液2。同時(shí)按照上述方法培養(yǎng)硬孔菌（R. vinctus) ASAF02 菌株獲得培養(yǎng)液后，過(guò)濾去除菌體，得到除菌濾液，即為濾液3。菌液或?yàn)V液噴霧濃縮得到的 濃縮物，即為濃縮制劑4。
[0051] 2、接種：以白木香（A.sinensis(Lour. )Gilg)為接種對(duì)象進(jìn)行接種，接種方法如 下：1)1)鉆洞接種：在6年樹(shù)齡白木香的自根部到地上50cm處部位鉆洞，洞深至3-5cm，將 上述接種菌絲1或菌液2分別注入洞中；通體結(jié)香技術(shù)接種：在6年樹(shù)齡的白木香上分別將 菌液2、濾液3、濃縮制劑4分別通過(guò)輸液裝置利用植物的蒸騰作用疏導(dǎo)至植物莖干、枝條、 根等各器官，促使整個(gè)植株內(nèi)部結(jié)香。結(jié)果表明，上述接種方式均可以使白木香結(jié)香。以濾 液3結(jié)合通體結(jié)香技術(shù)跟接種菌絲1、菌液2利用鉆洞法接種相比，濾液3結(jié)合通體結(jié)香技 術(shù)具有結(jié)香速度快、結(jié)香面大及結(jié)香距離長(zhǎng)的特點(diǎn)；濾液3結(jié)合通體結(jié)香技術(shù)也比相同體 積的菌液2、濃縮制劑4結(jié)合通體結(jié)香技術(shù)所獲得的沉香效果好。但是上述方法均可使白木 香在2個(gè)月內(nèi)結(jié)香。
[0052] 上述接種操作2個(gè)月，將結(jié)香的白木香砍下，剖香，然后進(jìn)行薄層鑒定。具體方法 為：取上述方法獲得的ASAF02菌株接種2個(gè)月獲得的沉香樣品粉末lg置于具塞三角瓶中， 加甲醇25ml，超聲處理60min，過(guò)濾，濾液定容至25ml，作為供試品溶液。野生沉香藥材（中 國(guó)藥典規(guī)定的對(duì)照藥材，購(gòu)自中國(guó)藥品檢定研宄院，批號(hào)：121222201102)的樣品和優(yōu)等的 野生沉香（2012年購(gòu)于海南沉香博覽會(huì)）及健康白木香（莖部磨成粉末），制備方法同上分 別作為對(duì)照藥材溶液，取6, 7-二甲氧基-2 (2-苯乙基）色酮加甲醇配制成每毫升含0. 05mg 6, 7-二甲氧基-2 (2-苯乙基）色酮的色酮對(duì)照品溶液。吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液和 色酮對(duì)照品溶液各5yl，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-乙醚（v : v = 10 : 1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)兩次，取出瞭干，置紫外光燈（254nm和365nm)下檢視，拍照。圖2 中的BK為健康的白木香，ST為色酮對(duì)照（6, 7-二甲氧基-2(2-苯乙基）色酮加甲醇），CK 為中國(guó)藥典規(guī)定的對(duì)照藥材，IW為ASAF02菌株接種（濾液3用通體結(jié)香技術(shù)輸液的沉香）2 個(gè)月的沉香。結(jié)果表明，硬孔菌（R. Vinctus)ASAF02菌株接種2個(gè)月后可促進(jìn)沉香的形成， 和野生沉香斑點(diǎn)接近（圖2)。
[0053] 實(shí)施例4硬孔菌（R. vinctus)ASAF02促進(jìn)馬來(lái)沉香產(chǎn)生沉香的效果驗(yàn)證
[0054] 以馬來(lái)沉香（Aquilaria malaccensis，樹(shù)齡為6年）為接種對(duì)象進(jìn)行接種，接種方 法參照實(shí)施例3的方法2)通體結(jié)香結(jié)果表明，上述接種方式3個(gè)月可以使馬來(lái)沉香結(jié)香， 和野生沉香斑點(diǎn)接近（圖3)。圖3中的BK為健康的白木香，ST為色酮對(duì)照（6, 7-二甲氧 基-2(2-苯乙基）色酮加甲醇），CK為中國(guó)藥典規(guī)定的對(duì)照藥材，BW為ASAF02菌株接種 (濾液3用通體結(jié)香技術(shù)輸液的沉香）3個(gè)月的沉香。結(jié)果表明，硬孔菌（R. vinctus) ASAF02 菌株接種3個(gè)月后可促進(jìn)沉香的形成，和野生沉香斑點(diǎn)接近。
[0055] 實(shí)施例5硬孔菌（R. vinctus) ASAF02促進(jìn)越南沉香產(chǎn)生沉香的效果驗(yàn)證
[0056] 以越南沉香（Aquilaria crassna，樹(shù)齡為6年）為接種對(duì)象進(jìn)行接種，接種方法參 照實(shí)施例3的方法2)通體結(jié)香結(jié)果表明，上述接種方式70天可以使越南沉香結(jié)香，和野生 沉香斑點(diǎn)接近（圖4)。圖4中，BK為健康的白木香，ST為色酮對(duì)照（6, 7-二甲氧基-2(2-苯 乙基）色酮加甲醇），CK為中國(guó)藥典規(guī)定的對(duì)照藥材，IW為ASAF02菌株接種（濾液3用通 體結(jié)香技術(shù)輸液的沉香）70天的沉香。結(jié)果表明，硬孔菌（R. vinctus) ASAF02菌株接種70 天后可促進(jìn)沉香的形成，和野生沉香斑點(diǎn)接近。
[0057] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 硬孔菌屬真菌在促進(jìn)沉香屬（Aquilaria)、擬沉香屬（Gyrinops)或其他誘導(dǎo)型植物 產(chǎn)生沉香中的應(yīng)用，其中，所述硬孔菌屬于真菌界Fungi，擔(dān)子菌門Basidiomycota，傘菌鋼 Agaricomycetes，硬孑L菌目Polyporales，硬孑L菌屬Rigidoporus0
2. 硬孔菌（R.vinctus)，其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏 編號(hào)為CGMCCNO. 9594。
3. 硬孔菌（R.vinctus)在促進(jìn)沉香屬（Aquilaria)、擬沉香屬（Gyrinops)或其他誘導(dǎo) 型植物產(chǎn)生沉香中的應(yīng)用。
4. 硬孔菌（R.vinctus)菌株、菌絲、菌株發(fā)酵液、發(fā)酵液除菌獲得的濾液、濾液中的 活性成分、菌株發(fā)酵液濃縮制劑、菌株發(fā)酵液濾液濃縮制劑中的至少一種作為促進(jìn)沉香屬 (Aquilaria)、擬沉香屬（Gyrinops)或其他誘導(dǎo)型植物結(jié)香的結(jié)香劑中的應(yīng)用。
5. -種結(jié)香劑，其特征在于，所述結(jié)香劑包括硬孔菌（R.vinctus)菌株、菌絲、菌株發(fā) 酵液、發(fā)酵液除菌獲得的濾液、菌株發(fā)酵液濃縮制劑、菌株發(fā)酵液濾液濃縮制劑中的至少一 種。
6. 如權(quán)利要求4或5所述的菌株發(fā)酵液的獲得方法為將硬孔菌（R.vinctus)接種于溫 度為15-35 °C的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到菌株發(fā)酵液。
7. -種促進(jìn)沉香屬（Aquilaria)、擬沉香屬（Gyrinops)或其他誘導(dǎo)型植物產(chǎn)生沉香的 方法，其特征在于，是將如權(quán)利要求4或5所述的結(jié)香劑接種于沉香屬（Aquilaria)、擬沉香 屬（Gyrinops)或其他誘導(dǎo)型植物的根、莖和/或分枝上。
8. 如權(quán)利要求7所述的促進(jìn)沉香屬（Aquilaria)、擬沉香屬（Gyrinops)或其他誘導(dǎo)型 植物產(chǎn)生沉香的方法，其特征在于，所述接種方式為刮皮接種、通體結(jié)香技術(shù)接種或鉆洞接 種方式。
9. 如權(quán)利要求8所述的促進(jìn)沉香屬（Aquilaria)、擬沉香屬（Gyrinops)或其他誘導(dǎo)型 植物產(chǎn)生沉香的方法，其特征在于，所述通體結(jié)香技術(shù)接種方式中，所得的菌液、無(wú)菌濾液、 菌株發(fā)酵液濃縮制劑、菌株發(fā)酵液濾液濃縮制劑中的至少一種直接用通體結(jié)香法輸入沉香 屬的樹(shù)上。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種硬孔菌及其促進(jìn)沉香屬植物產(chǎn)生沉香的應(yīng)用。本發(fā)明提供了的硬孔菌屬于真菌界(Fungi)，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，傘菌鋼(Agaricomycetes)，硬孔菌目(Polyporales)，薄孔菌科(meripilaceae)，硬孔菌屬(Rigidoporus)。本發(fā)明提供的硬孔菌從白木香中分離獲得，用于促進(jìn)以白木香為代表的沉香屬結(jié)香，形成的沉香層比較厚且穿透面大。本發(fā)明提供了的硬孔菌能提高沉香品質(zhì)，對(duì)沉香生產(chǎn)有著重要的意義。CGMCC No.959420140909
【IPC分類】A01P21-00, C12R1-645, A01G7-06, C12N1-14, A01N63-04
【公開(kāi)號(hào)】CN104845892
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510179261
【發(fā)明人】陳旭玉, 魏建和, 甘炳春, 劉洋洋, 楊云, 蘇智, 張爭(zhēng)
【申請(qǐng)人】中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所
【公開(kāi)日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年4月15日