的DBP污染土壤在第10天，土壤中DBP的降解率達(dá)到了 65%，相比對照提高 了 46% ;另外，在添加了動物堆肥并接菌的DBP污染土壤中，其第十天的DBP降解率達(dá)到了 88%，ofe/?ciasp. 2D菌與堆肥結(jié)合使用，可高效修復(fù)DBP污染的土壤，對降低農(nóng)業(yè)土壤 環(huán)境中DBP污染具有十分廣泛的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0026] 圖1為Providencia sp. 2D在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天的生長形態(tài)。
[0027] 圖2為/sp. 2D的掃描電鏡圖。
[0028]圖 3 為/sp. 2D 的 16SrDNA 的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0029] 圖4為/sp. 2D對DBP和鄰苯二甲酸的降解動力學(xué)曲線。
[0030] 圖5為/sp. 2D對不同土壤處理中DBP的降解效果。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本 發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單 修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù) 人員所熟知的常規(guī)手段。
[0032] 實(shí)施例1鄰苯二甲酸二丁酯降解菌的分離與鑒定 1、培養(yǎng)基配方 無機(jī)鹽培養(yǎng)液（MSM，g/L):K2HP04:5. 8 ;KH2P04:4.5 ; (NH4)2S04:2. 0 ;MgCl 2:0.1 6 ;CaCl 2: 0? 02 ;Na2Mo04?2H20 :0? 0024 ;FeCl3:0. 0018 ;MnCl2 ?2H20 :0? 0015;調(diào)節(jié)無機(jī)鹽培養(yǎng)液的最 終pH為7. 5。添加DBP，使其在無機(jī)鹽培養(yǎng)液中的濃度為50 mg/L，DBP作為唯一碳源。
[0033] 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（LB):酵母粉5. 0 g，蛋白胨10. 0 g，氯化鈉10. 0 g，加超純 水至1L，調(diào)節(jié)pH= 7. 0。121°C滅菌20分鐘。固體平板則添加1. 5% (W/V)瓊脂粉。
[0034] 2、分離與鑒定 分離方法采用樣品懸液搖瓶法：稱取5 g堆肥樣品（取自農(nóng)場動物堆肥）于含有50 mL 無菌水的150 mL三角瓶中，在30°C，140 rpm條件下培養(yǎng)3天后取5 mL堆肥懸液加入100 mL含DBP (50 mg/L)的上述MSM培養(yǎng)基中。經(jīng)30°C，140 rpm下培養(yǎng)7天后，每次按取1 mL的接種量連續(xù)富集、轉(zhuǎn)接10次，并相應(yīng)提高M(jìn)SM培養(yǎng)基中DBP含量至1000 mg/L (第二 次轉(zhuǎn)接，MSM培養(yǎng)基中DBP的含量為100mg/L，之后每轉(zhuǎn)接一次，MSM培養(yǎng)基中DBP的含量提 高100mg/L)。然后將轉(zhuǎn)接10次的培養(yǎng)液稀釋10 3~10 5涂布于LB固體平板上，30°C倒置 培養(yǎng)1~3天。待平板上長出單菌落后，挑取單菌落多次劃線純化，分離獲得一株細(xì)菌，編 號為2D。然后將菌株接種于LB固體平板上30°C倒置培養(yǎng)7天，觀察其菌落形態(tài)。LB平板 培養(yǎng)7天的菌落呈橘黃色，質(zhì)地膏狀，豐厚濕潤，易被挑起，邊緣較薄(見圖1 )。
[0035] 掃描電鏡樣品制備與觀察：將菌種2D的單菌落接入含有10 mL的LB液體培養(yǎng)基 過夜活化。吸取800 yL菌液經(jīng)8000 rpm離心3~5 min，去上清液，加入500 yL PBS 洗菌3次。在收獲的菌體沉淀中加入1 mL 2.5% (v/v)戊二醛充分混勻，4°C靜置過夜。然 后再次經(jīng)8000 rpm離心3~5 min，去上清液，加入500 yL PBS洗菌3次。隨后將菌體 分別在30%，50%，70%，85%，90%和100%的梯度乙醇中脫水2次，每個梯度約浸泡15 min，然 后8000 rpm離心去上清液，最后用乙酸異戊酯置換乙醇2次，每次20 min，方法同乙醇脫 水。菌體經(jīng)過〇)2干燥后制片觀察。掃描電鏡下可以觀察到該菌呈長桿狀，長約1.5~3.0 ym，寬約0.5~0.8 ym (見圖2)。
[0036] 菌株的生理生化鑒定指標(biāo)包括12項(xiàng)：甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、吲哚反應(yīng)、檸檬酸鹽 利用、肌醇產(chǎn)酸試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、尿酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硝酸鹽還 原、氧化酶試驗(yàn)和葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
[0037]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 普羅威登斯菌sp. )2D在降解鄰苯二甲酸二丁醋中的應(yīng)用，其特征在 于，該菌于2015年1月22日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏編號為CCTCC M2015057。
2. 普羅威登斯菌sp. 2D在降解鄰苯二甲酸中的應(yīng)用，其特征在于， 該菌于2015年1月22日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏編號為CCTCCM 2015057。
3. 普羅威登斯菌2D在制備降解鄰苯二甲酸二丁酯或/和鄰苯二甲 酸的制劑中的應(yīng)用，其特征在于，該菌于2015年1月22日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)，保藏編號為CCTCCM2015057。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，將普羅威登斯菌sp. 2D活化后制得的菌懸液接入受鄰苯二甲酸二丁酯污染的介質(zhì)中。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述介質(zhì)為水、土壤。
6. -種降解鄰苯二甲酸二丁酯的生物菌劑，其特征在于，包括普羅威登斯菌 sp. 2D，該菌于2015年1月22日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)， 保藏編號為CCTCCM2015057。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的生物菌劑，其特征在于，還包括動物糞堆肥。
【專利摘要】本發(fā)明屬于環(huán)境污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了普羅威登斯菌（Providencia sp.）2D在降解鄰苯二甲酸二丁酯中的應(yīng)用，所述普羅威登斯菌Providencia sp.2D于2015年1月22日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保藏編號為CCTCC M2015057。該菌株在72h對高濃度的DBP（1000mg/L）降解效率超過80%，對低濃度的DBP（200mg/L）幾乎完全降解；該菌株還能夠降解DBP的中間產(chǎn)物鄰苯二甲酸；該菌還可降解污染土壤中的DBP，因此可用于改良修復(fù)DBP污染土壤，本發(fā)明所述應(yīng)用對環(huán)境中DBP的治理具有實(shí)際的意義。CCTCC M201505720150122
【IPC分類】C12R1-01, A62D101-28, C12N1-20, B09C1-10, A62D3-02
【公開號】CN104845900
【申請?zhí)枴緾N201510066089
【發(fā)明人】蔡全英, 莫測輝, 趙海明, 李彥文, 李慧, 杜歡, 余忠雄, 陳學(xué)斌
【申請人】暨南大學(xué)
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年2月9日