淫羊藿苷的新用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及淫羊藿苷的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 干細(xì)胞具有多向分化潛能和自我更新的能力，在細(xì)胞替代治療、基因治療、組織工 程等方面具有良好的應(yīng)用前景。近年來(lái)關(guān)于干細(xì)胞基礎(chǔ)與臨床的研宄突飛猛進(jìn)、日新月異， 使人們對(duì)干細(xì)胞有了更深刻的理解。從全能性胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）的研宄，到成體干細(xì) 胞的發(fā)現(xiàn)，再到人們通過(guò)體細(xì)胞重新編程而得到的誘導(dǎo)全能干細(xì)胞（iPS)，無(wú)不體現(xiàn)了科研 工作者對(duì)干細(xì)胞研宄的智慧和傾注的心血。人們對(duì)于干細(xì)胞的大規(guī)模、常規(guī)臨床應(yīng)用報(bào)以 了極大的熱情和希望，但是由于胚胎干細(xì)胞的免疫排斥反應(yīng)、致瘤性、倫理道德問(wèn)題等因素 的制約，極大的限制了其臨床應(yīng)用。
[0003] 通過(guò)體細(xì)胞重新編程而得到iPS是近年干細(xì)胞研宄的熱點(diǎn)，人們采用體細(xì)胞核移 植（SNCT)，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將特定基因（Oct-4、Nanog等）、小分子非病毒載體導(dǎo)入體細(xì)胞 等方法均成功獲得了 iPS。0ct_4和Nanog是兩種維持干細(xì)胞多能性和自我更新的最為重 要的轉(zhuǎn)錄因子。它們通常只在多能干細(xì)胞中表達(dá)，在分化細(xì)胞中不表達(dá)。目前多采用成纖 維細(xì)胞、表皮細(xì)胞作為供體細(xì)胞進(jìn)行逆分化而獲得多能性細(xì)胞，這些研宄工作證明了細(xì)胞 的逆分化性。但成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞均為終末分化細(xì)胞，其逆分化能力差、重編程為多能 性細(xì)胞所需要的時(shí)間比較長(zhǎng)、效率低。最新研宄表明，應(yīng)用具有一定干細(xì)胞特性的成體干細(xì) 胞可以更加容易的得到iPS，如Kim等報(bào)道：神經(jīng)干細(xì)胞可以簡(jiǎn)化重編程步驟得到iPS ;同 時(shí)研宄表明，體外應(yīng)用小分子化合物可以增加體細(xì)胞逆分化比例，提高逆分化效率。
[0004] 然而，現(xiàn)階段所用成體細(xì)胞移植治療某些疾病，但成體細(xì)胞多能性差，影響治療效 果，現(xiàn)在傳統(tǒng)誘導(dǎo)細(xì)胞多能性的方案是病毒或基因改造，這樣處理的細(xì)胞不利于移植給人 或者動(dòng)物。
[0005] 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUMSCs)是近年人們從胎兒臍帶華爾通氏膠（Whartonps Jelly)部位分離得到的基質(zhì)細(xì)胞。hUCMSCs具有一定干細(xì)胞特性，其多向分化潛能和可塑 性已得到證實(shí)。特定條件下，hUCMSCs可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、胰島細(xì)胞、 神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及生殖細(xì)胞等。鑒于臍帶間充質(zhì)具有一定的分化多能性、可塑性強(qiáng)、 排異反應(yīng)低、無(wú)倫理道德?tīng)?zhēng)議等優(yōu)點(diǎn)，hUMSCs將有望成為自體與同種異體移植及細(xì)胞替代 治療的理想細(xì)胞來(lái)源。雖然hUCMSCs具有一定干細(xì)胞特性，但其分化能力仍具有一定局限 性。若能利用藥物干預(yù)誘導(dǎo)hUCMSCs，使其獲得像ES -樣的多能性，則可以避免應(yīng)用胚胎干 細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫排斥、倫理問(wèn)題及應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)iPS所致的操作復(fù)雜性、致瘤性 等缺點(diǎn)。
[0006] 中醫(yī)學(xué)"腎藏精"理論認(rèn)為腎精的盛衰決定著人體的生長(zhǎng)、發(fā)育與生殖，其內(nèi)涵及 功能與干細(xì)胞具有多向分化及自我增殖的能力密切相關(guān)，而且許多補(bǔ)腎益精中藥具有促進(jìn) 干細(xì)胞分化及增殖的功能。鑒于此，本發(fā)明以〇ct-4多能性調(diào)控基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)，通過(guò)觀察常 用補(bǔ)腎中藥有效成分對(duì)hUMSCs多能性調(diào)控基因Oct-4表達(dá)的影響，篩選出影響hUMSCs多 能性的補(bǔ)腎中藥活性成分；通過(guò)考察所篩選出的活性成分對(duì)hUMSCs向內(nèi)、中、外三胚層細(xì) 胞分化的影響，確證補(bǔ)腎中藥活性成分誘導(dǎo)hUMSCs多能性的作用及應(yīng)用價(jià)值。
[0007] 在諸多補(bǔ)腎中藥有效成分中，淫羊藿苷為小檗科植物淫羊藿（Epimedium grandiflorum Morr.)的地上部分，分子式為C33H4(l015，分子量676. 65,為淡黃色針狀結(jié)晶， 熔點(diǎn)231-232°C。溶于乙醇、乙酸乙酯、不溶于醚、苯、氯仿。淫羊藿苷具有促進(jìn)造血功能、免 疫功能及骨代謝等功效，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研宄表明：淫羊藿能增加心腦血管血流量、促進(jìn)造血 功能、免疫功能及骨代謝，具有抗衰老、抗腫瘤等功效，被用于本申請(qǐng)誘導(dǎo)hUMSCs多能性的 研宄中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供淫羊藿苷的新用途。
[0009] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0010] 淫羊藿苷在增強(qiáng)干細(xì)胞多能性中的用途。
[0011] 優(yōu)選的，上述淫羊藿苷的用途，通過(guò)淫羊藿苷處理干細(xì)胞，提高干細(xì)胞多能性，再 移植干細(xì)胞給動(dòng)物。
[0012] 優(yōu)選的，上述淫羊藿苷的用途，應(yīng)用于誘導(dǎo)培養(yǎng)用于治療急性肝損傷或腦缺血損 傷時(shí)的待移植細(xì)胞的培養(yǎng)液。
[0013] 優(yōu)選的，上述淫羊藿苷的用途，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞的方法為：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞于 含有100 yM淫羊藿苷的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，每3天換液一次，培養(yǎng)條件為37°C、5% C02， 得到多能性增強(qiáng)的干細(xì)胞，所述完全培養(yǎng)基為DMEM-F12培養(yǎng)基+20% FBS (胎牛血清）+1 % LG (谷氨酰胺）+1 % PS (青霉素鏈霉素）+10ng/mlEGF (表皮生長(zhǎng)因子）+10ng/mlbFGF (堿性 成纖維生長(zhǎng)因子）。
[0014] 本發(fā)明的有益效果是：
[0015] 淫羊藿苷作用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞一周能夠增強(qiáng)其多能性，促進(jìn)其向神經(jīng)細(xì)胞，心 肌細(xì)胞，胰島細(xì)胞的分化，明確了 hUMSCs(人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞）體外具有向三胚層細(xì)胞分 化的能力，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)建立代表三個(gè)胚層不同器官的損傷模型，移植ICA干預(yù)后的hUMSCs，通 過(guò)評(píng)價(jià)模型動(dòng)物各項(xiàng)機(jī)能指標(biāo)和移植細(xì)胞分化能力情況，進(jìn)一步驗(yàn)證了補(bǔ)腎中藥活性成分 對(duì)hUMSCs分化多能性的影響。同時(shí)通過(guò)研宄淫羊藿苷對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在基因組整體 水平的變化，表明淫羊藿苷作用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞一周后，能夠降低多能性調(diào)控基因〇ct-4 甲基化水平和促進(jìn)組蛋白H3K9乙酰化水平。
[0016] 通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，最終結(jié)果表明淫羊藿苷作用于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后能夠增強(qiáng)其多 能性，揭示出淫羊藿苷作用于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分子生物學(xué)機(jī)制，為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1是hUCMSCs的原代及傳代培養(yǎng)形態(tài)學(xué)變化圖（倒置顯微鏡，X 100)，a :原代 培養(yǎng)5天，b :原代培養(yǎng)一周，c :原代培養(yǎng)兩周，d :傳代培養(yǎng)P1 ;
[0018] 圖2是免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果圖，
[0019] a:CD29(X400)，b:CD44(X400)，c:CD90(X200) ;d:C45(X200)，e:CD31(X200), f:CD34(X200);
[0020] 圖3是流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表型圖；
[0021] 圖4是淫羊藿苷上調(diào)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞多能性基因Oct-4表達(dá)圖，
[0022] *P〈0. 05. **P〈0. 01 ;
[0023] 圖5是向神經(jīng)樣細(xì)胞誘導(dǎo)形態(tài)變化圖，
[0024] a:對(duì)照組（X100) ;b:誘導(dǎo) 4h(X100) ;c:誘導(dǎo) 6h(X200);
[0025] 圖6是免疫熒光鑒定結(jié)果圖，
[0026] a:對(duì)照組，b :nestin，c:GFAP，d :Map_2 (X 200);
[0027] 圖7是向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)形態(tài)變化圖，
[0028] a:對(duì)照組（X2〇0) ;b:誘導(dǎo) 4 周組（X2〇0);
[0029] 圖8是RT-PCR檢測(cè)cTNI mRNA表達(dá)結(jié)果圖，
[0030] a:內(nèi)參基因GAPDH;b:目的基因cTNI;1 :未誘導(dǎo)組；2 :誘導(dǎo)組；
[0031] 圖9是向胰島細(xì)胞誘導(dǎo)形態(tài)變化圖，
[0032]a未誘導(dǎo)組（X 100)，b誘導(dǎo)12天組（X 100);
[0033] 圖10是雙硫腙染色結(jié)果圖，
[0034]a:未誘導(dǎo)組（X200)，b:誘導(dǎo) 12 天組（X200);
[0035] 圖11是細(xì)胞移植3天對(duì)小鼠血肌酐和尿素氮的影響圖；
[0036] 圖12是細(xì)胞移植7天對(duì)小鼠血肌酐和尿素氮的影響圖；
[0037] 圖13是活體成像系統(tǒng)對(duì)腎組織體外拍照結(jié)果圖一一細(xì)胞移植3d和7d腎組織熒 光信號(hào)強(qiáng)度，備注：腎組織依次的順序?yàn)閷?duì)照組、模型組、MSC組、MSC+I組；
[0038] 圖14是細(xì)胞移植3天和7天腎組織熒光信號(hào)強(qiáng)度圖；
[0039] 圖15是細(xì)胞移植3d對(duì)腎組織形態(tài)學(xué)的影響（X 100)圖；
[0040] 圖16是細(xì)胞移植7d對(duì)腎組織形態(tài)學(xué)的影響（X 100)圖；
[0041] 圖17是細(xì)胞移植3d hUCMSCs向腎小管上皮細(xì)胞分化情況（X 200)圖，其中，紅色 熒光為DIR標(biāo)記hUCMSCs、綠色熒光為腎小管上皮細(xì)胞標(biāo)記物Cadherin、藍(lán)色熒光為DAPI;
[0042] 圖18是細(xì)胞移植7d hUCMSCs向腎小管上皮細(xì)胞分化情況（X 200)圖，其中，紅色 熒光為DIR標(biāo)記hUCMSCs、綠色熒光為腎小管上皮細(xì)胞標(biāo)記物Cadherin、藍(lán)色熒光為DAPI;
[0043] 圖19是四氯化碳造模24小時(shí)對(duì)小鼠ALT和AST的影響圖；
[0044] 圖20是細(xì)胞移植3天對(duì)小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的影響圖；
[0045] 圖21是細(xì)胞移植7天對(duì)小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的影響圖；
[0046] 圖22是移植細(xì)胞3天和7天對(duì)肝臟系數(shù)的影響圖；
[0047] 圖23是細(xì)胞移植3d和7d肝組織熒光信號(hào)強(qiáng)度圖，備注：肝組織依次的順序?yàn)閷?duì) 照組、模型組、MSC組、MSC+I組；
[0048] 圖24是細(xì)胞移植3天和7天肝組織熒光信號(hào)強(qiáng)度圖；
[0049] 圖25是細(xì)胞移植3d對(duì)肝組織形態(tài)學(xué)的影響（X 100)