產(chǎn)1,3-二羥基丙酮重組基因工程菌的固定化及應(yīng)用
【專利說(shuō)明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域:本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)，涉及產(chǎn)1，3_ 二羥基丙酮重組基因工程菌的固定化及應(yīng)用。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]1，3-二羥基丙酮一種重要的化工、生化原料，醫(yī)藥、農(nóng)藥合成中間體和多功能食品添加劑，用途十分廣泛。二羥基丙酮的合成方法主要有貴重金屬催化氧化法和微生物法。重金屬催化氧化甘油的合成法，由于無(wú)法克服催化選擇性差的致命缺點(diǎn)，致使甘油轉(zhuǎn)化率低于40%，DHA的產(chǎn)率低于25%。工業(yè)生產(chǎn)方法目前是利用微生物分批發(fā)酵。該法是在菌體生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)臅r(shí)期，利用菌體產(chǎn)生的脫氫酶以甘油為底物進(jìn)行脫氫反應(yīng)，產(chǎn)生DHA。用于生產(chǎn)DHA的微生物主要是醋酸桿菌屬(Acetobacter)和葡萄糖桿菌屬(Gluconobacter)微生物，尤其是弱氧化醋酸桿菌(Acetobacter Suboxy-dans)和氧化葡萄糖桿菌(GluoonobacterOxydans)。菌種在復(fù)蘇后先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)，待菌種達(dá)到一定濃度后，接種到含有甘油的發(fā)酵培養(yǎng)基當(dāng)中，經(jīng)過(guò)60-80h的耗氧發(fā)酵后，再將發(fā)酵液一次放出，經(jīng)分離純化得到DHA。每一個(gè)分批發(fā)酵過(guò)程都經(jīng)歷接種、生長(zhǎng)繁殖、菌體衰老進(jìn)而結(jié)束發(fā)酵，最終提取出產(chǎn)物。目前已有采用分流加甘油方法，在菌體生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)，并在產(chǎn)物DHA達(dá)到一定水平后，放出部分產(chǎn)物，并補(bǔ)加原料和培養(yǎng)基，這樣就可以減少達(dá)到生產(chǎn)水平的生物量的時(shí)間，提高底物甘油的利用率，節(jié)約成本。分批發(fā)酵的特點(diǎn)是微生物所處的環(huán)境是不斷變化的，發(fā)生雜菌污染，能夠很容易終止操作。在發(fā)酵生產(chǎn)中，使用的菌種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，把它們接種到發(fā)酵罐新鮮培養(yǎng)基時(shí)，幾乎不出現(xiàn)調(diào)整期，這樣可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量生長(zhǎng)旺盛的菌體，有利于縮短生產(chǎn)周期。但該法的主要問題是底物甘油和產(chǎn)物DHA在培養(yǎng)基中的濃度過(guò)高時(shí)產(chǎn)生了高滲透壓，使得發(fā)酵菌體裂解、失活，從而導(dǎo)致DHA的產(chǎn)率難以提高。
[0004]隨著固定化細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的研宄者關(guān)注于固定化大腸桿菌細(xì)胞。固定化大腸桿菌細(xì)胞具有如下優(yōu)勢(shì):相較于游離細(xì)胞，固定化細(xì)胞在催化反應(yīng)過(guò)程中，其質(zhì)粒更加穩(wěn)定，目的基因產(chǎn)物活力較高，產(chǎn)物易于分離純化。自1959年Hattori首次將大腸桿菌細(xì)胞吸附在樹脂上實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌細(xì)胞固定化以來(lái)，固定大腸桿菌活細(xì)胞或稱為固定化增殖大腸桿菌細(xì)胞的研宄工作相繼展開。
[0005]超分子通常是指由兩種或兩種以上分子依靠分子間相互作用結(jié)合在一起，組成復(fù)雜的、有組織的聚集體，并保持一定的完整性使其具有明確的微觀結(jié)構(gòu)和宏觀特性。人們可以根據(jù)超分子自組裝原則，使用分子間的相互作用力作為工具，把具有特定的結(jié)構(gòu)和功能的組分或建筑模塊按照一定的方式組裝成新的超分子化合物。這些新的化合物不僅僅能表現(xiàn)出單個(gè)分子所不具備的特有性質(zhì)，還能大大增加化合物的種類和數(shù)目。如果人們能夠很好的控制超分子自組裝過(guò)程，就可以按照預(yù)期目標(biāo)更簡(jiǎn)單、更可靠的得到具有特定結(jié)構(gòu)和功能的化合物。MCM-41，脫鋁超穩(wěn)Y沸石，中孔碳等都是具有規(guī)則孔道結(jié)構(gòu)、性能優(yōu)異的可用作主客體化學(xué)的超分子。
[0006]本發(fā)明以超分子模板固定重組基因工程菌，重組基因工程菌是克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)基因組DNA為模板，運(yùn)用PCR擴(kuò)增得到編碼甘油脫氫酶(⑶H)的基因(gldA)，并克隆到大腸桿菌表達(dá)載體PET 28a上，構(gòu)建克隆載體PET-gldA，并在E.ColiJ M I O 9中成功表達(dá)。構(gòu)建的甘油脫氫合成1，3-二羥基丙酮固定化工程菌，在含有甘油的培養(yǎng)基中發(fā)酵合成1，3- 二羥基丙酮。通過(guò)過(guò)濾發(fā)酵液、有機(jī)溶劑萃取和組合溶劑重結(jié)晶等獲得產(chǎn)品1，3-二羥基丙酮。產(chǎn)物表達(dá)量最好可達(dá)120g/L，重復(fù)利用20次后，產(chǎn)物表達(dá)量仍可達(dá)107g/L。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明目的在于提供產(chǎn)1，3- 二羥基丙酮重組基因工程菌的固定化方法。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供產(chǎn)1，3-二羥基丙酮的固定化重組大腸桿菌的方法及應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明是通過(guò)下述方法實(shí)現(xiàn)的:
用超分子模板固定大腸桿菌表達(dá)甘油脫氫酶基因(gldA)的工程菌。工程菌的構(gòu)建是是以克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)基因組DNA為模板，運(yùn)用PCR擴(kuò)增得到編碼甘油脫氫酶(⑶H)的基因(gldA)，并克隆到大腸桿菌表達(dá)載體PET 28a上，構(gòu)建克隆載體PET-gldA，并在E.Coli JMlO 9中成功表達(dá)。是用超分子模板固定的重組基因工程菌在含甘油的培養(yǎng)基中發(fā)酵制備1，3_ 二羥基丙酮。
[0011]質(zhì)粒子及菌株:
克隆載體PET28a，大腸桿菌E.Coli JMlO 9購(gòu)自商業(yè)公司。
[0012]限制性內(nèi)切酶，Taq酶，T4 DNA連接酶均購(gòu)自大連寶生物公司。MCM-41，脫鋁超穩(wěn)Y沸石，中孔碳均來(lái)自江南大學(xué)。其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純化學(xué)試劑。
[0013]克雷伯桿菌分離培養(yǎng)基:蒸飽水100mL,甘油5g, NaCl 5g,酵母粉5 g，葡萄糖20g,瓊脂粉15g,調(diào)ρΗ7.0，0.IMPa滅菌20min.冷卻至35°C?45°C，加入尼爾紅(Nile Red)2mL/L(0.30mg Nile Red溶于10mL 二甲基亞砜)，無(wú)菌條件下倒入培養(yǎng)皿，冷卻后備用。
[0014]富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基:蒸餾水100mL,酵母粉10 g,瓊脂粉1g,甘油3g, (NH4)2SO4 5g,調(diào) pH7.0,0.1MPa 滅菌 1min.產(chǎn)品發(fā)酵培養(yǎng)基:
磷酸鹽緩沖液的配制:蒸餾水 100mL, NaH2PO4.12H20 8.95g，KH2PO4 1.5g, ρΗ7.0，0.1MPa 滅菌，15min ?20min,備用。
[0015]基因工程菌富集培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基:發(fā)酵培養(yǎng)基為添加15.0%甘油的LB培養(yǎng)基，以鼓入空氣作為基因工程菌氧化劑；培養(yǎng)溫度為35°C。
[0016]克雷伯桿菌脫氫酶基因的獲得與重組質(zhì)粒的構(gòu)建:
通過(guò)對(duì)1，3-二輕基丙酮合成酶gldA進(jìn)行序列分析，設(shè)計(jì)了保守引物:primer-1:5'-GGTGGGATCCTACATGCGCACTTATTTGAG-3'primer-11:5'-AATGCTCGAGCGAATTAACGCGCCAGCCAC-3'。以克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)基因組DNA為模版擴(kuò)增得到一個(gè)大的片段，從中分析得到DHA合成酶基因1133bp大小的開放閱讀框，根據(jù)獲得的序列設(shè)計(jì)DHA合成酶基因gldA的擴(kuò)增引物，在上下游分別引入了 XbaI和EcoRI位。對(duì)PET28a和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行XbaI和EcoRI雙酶處理，回收后在T4DNA連接酶作用下16°C連續(xù)過(guò)夜，以備轉(zhuǎn)化。
[0017]PCR 擴(kuò)增:97°C預(yù)變性 10min，94°C變形 60s，58°C退火 30s，72°C延伸 60_120s，30個(gè)循環(huán)后72°C延伸lOmin。
[0018]將gldA基因和載體質(zhì)粒PET28a同時(shí)進(jìn)行XbaI和EcoRI雙酶切，酶切后利用T4連接酶將gldA基因連接到質(zhì)粒PET28a中，得重組質(zhì)粒PET-gldA。
[0019]大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化:
根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后接于ImlLB培養(yǎng)集中36 °C、150r/min振蕩培養(yǎng)2h，均勻涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上篩選重組大腸桿菌。篩選得到的菌株利用菌落PCR和限制性內(nèi)切酶酶切重組質(zhì)粒驗(yàn)證重組子。
[0020]超分子模板固定:
將適量超分子和5mLPH7.0的磷酸緩沖液加入25mL的錐形瓶?jī)?nèi)，然后再加入2mL的激活劑和2mL的大腸桿菌工程菌溶液，最后向溶液中滴加7.5%的戊二醛直至溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75%。固定化反應(yīng)在180r/min，15度的條件下進(jìn)行2h，再經(jīng)過(guò)濾、50mL PH為7.0的磷酸液洗滌后得到固定化大腸桿菌工程菌。
[0021 ] 克雷伯桿菌發(fā)酵及DHA的提取:
前培養(yǎng)是在L-試管中，以無(wú)菌操作加入5ml富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，以無(wú)菌牙簽接入克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)的單菌落。35°C、120r/min 培養(yǎng) 15h。將前培養(yǎng)物 0.5ml 接種至含有10ml富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30°C、130r/min振蕩培養(yǎng)24h。4°C，6000*g無(wú)菌離心lOmin，棄上清，在離心管中以無(wú)菌磷酸鹽緩沖液振蕩混勾，然后在4°C，6000*g無(wú)菌離心12min，棄上清。將前培養(yǎng)物0.5ml接種至含有10ml富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，35°C、130r/min振蕩培養(yǎng)24h。4°C，6000*g無(wú)菌離心lOmin，棄上清，在離心管中以無(wú)菌磷酸鹽緩沖液振蕩混勻，再次在4°C，6000*g無(wú)菌離心12min，棄上清。在分別將不含有富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的菌體無(wú)菌接入10瓶含有10m發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30°C?37°C、130r/min振蕩培養(yǎng)72h。
[0022]固定化重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)1，3- 二羥基丙酮:
-70°C保藏的固定化重組大腸桿菌在LB培養(yǎng)基平板上活化，以滅菌牙簽挑取單菌落接于20mlLB培養(yǎng)基中，30°C?37°C培養(yǎng)過(guò)夜，以2%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入I?2mmol/L的IPTG誘導(dǎo)gldA的表達(dá)，發(fā)酵培養(yǎng)72h。
[0023]發(fā)酵產(chǎn)物的分離:發(fā)酵收獲后，離心分離和回收催化酶，發(fā)酵母液使用乙酸丁酯萃取，將萃取所得的有機(jī)濃縮后，使用乙酸丁酯和石油醚(1:3?4體積)重結(jié)晶得到產(chǎn)品。
[0024]本發(fā)明的固定化菌株，產(chǎn)物表達(dá)量高，最高可達(dá)120g/L，重復(fù)利用性好，重復(fù)利用15次后，產(chǎn)物表達(dá)量仍可達(dá)100g/L，將對(duì)1，3_ 二羥基丙酮的生物發(fā)酵制備具有積極的作用，應(yīng)用前景廣闊。
[0025]
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合具體的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不限于這些具體的實(shí)施例，而所有的實(shí)施例均按上述的操作步驟操作。
[0027]實(shí)施例1、
質(zhì)粒子及菌株: 克隆載體PET28a，大腸桿菌E.Coli JMlO 9購(gòu)自商業(yè)公司。
[0028]限制性內(nèi)切酶，Taq酶，T4 DNA連接酶均購(gòu)自大連寶生物公司。MCM-41來(lái)自江南大學(xué)。其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純化學(xué)試劑。
[0029]克雷伯桿菌分離培養(yǎng)基:蒸飽水100mL,甘油5g, NaCl 5g,酵母粉5 g，葡萄糖20g,瓊脂粉 15g,調(diào) ρΗ7.0，0.IMPa 滅菌 20min.冷卻至 35°C，加入尼爾紅(Nile Red)2mL/L(0.30mg Nile Red溶于10mL 二甲基亞砜)，無(wú)菌條件下倒入培養(yǎng)皿，冷卻后備用。
[0030]富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基:蒸餾水100mL,酵母粉10 g,瓊脂粉10g，甘油3g，(NH4)2SO4 5g,調(diào) pH7.0,0.1MPa 滅菌 1min.產(chǎn)品發(fā)酵培養(yǎng)基:
磷酸鹽緩沖液的配制:蒸餾水 100mL, NaH2PO4.12H20 8.95g，KH2PO4 1.5g, ρΗ7.0，0.1MPa 滅菌，15min ?20min,備用。
[0031]基因工程菌富集培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基:發(fā)酵培養(yǎng)基為添加15.0%甘油的LB培養(yǎng)基，以鼓入