多層級(jí)固定化乳糖酶的制備方法、該方法制得的多層級(jí)固定化乳糖酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種固定化乳糖酶的制備方法、該方法制得的多層級(jí)固定化乳糖酶及用該固定化乳糖酶制備低聚半乳糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]高效利用乳糖酶是解決困擾我國(guó)人民的“乳糖不耐癥”，促進(jìn)乳制品產(chǎn)業(yè)發(fā)展的有效手段之一。乳及乳制品有著“近乎完美食物”的美稱(chēng)，具有巨大的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而其中的主要碳水化合物是乳糖，正常情況下，這些乳糖應(yīng)該在人體內(nèi)的乳糖酶的作用下水解成葡萄糖和半乳糖之后被吸收并進(jìn)入血液。但是，有很多人由于體內(nèi)缺乏這種酶，飲用牛奶后常會(huì)引起對(duì)乳糖的消化不良現(xiàn)象，出現(xiàn)腹?jié)q、腸鳴、急性腹痛甚至腹瀉等癥狀。已知遺傳上有缺乏乳糖酶的人。如果給這樣的人以過(guò)剩的乳糖，則未消化的乳糖進(jìn)入人體循環(huán)系統(tǒng)后，會(huì)引起白內(nèi)障等癥狀。通過(guò)外源乳糖酶水解乳中的乳糖生產(chǎn)低乳糖奶是目前克服乳糖不耐癥最好、最安全且有效和實(shí)用的方法，其原理是利用乳糖酶將乳糖水解為易被人體吸收的單糖，如葡萄糖和半乳糖。
[0003]低聚半乳糖是一種具有天然屬性的功能性低聚糖，是能夠被人體腸內(nèi)8大有益菌所利用的營(yíng)養(yǎng)源和有效的增殖因子，能有效改善人體腸道的消化吸收功能。新生兒的消化功能比較薄弱，所以嬰幼兒奶粉中都添加了低聚半乳糖的營(yíng)養(yǎng)成分，它不但能改善嬰兒的消化功能，還能促進(jìn)嬰兒體內(nèi)鈣的吸收，從而增強(qiáng)嬰兒的免疫力。同時(shí)，低聚半乳糖也是開(kāi)發(fā)用于應(yīng)對(duì)逐漸增多的高血壓、糖尿病、各種口腔及消化系統(tǒng)疾病等社會(huì)問(wèn)題的保健食品的主要成分之一，具有廣闊的市場(chǎng)前景。
[0004]低聚半乳糖的制備主要有三個(gè)途徑:從天然原料中提取、酶法合成和化學(xué)合成。但是自然界中含低聚半乳糖的天然原料極少，且低聚半乳糖分離提取困難；化學(xué)合成法需要使用大量的化學(xué)試劑，易造成化學(xué)物質(zhì)殘留。雖然現(xiàn)有的酶法合成的生產(chǎn)工藝較簡(jiǎn)單，但是酶制劑價(jià)格較為昂貴、不能重復(fù)利用且生產(chǎn)周期長(zhǎng)，因此難以被乳品生產(chǎn)企業(yè)接受。而且，以商業(yè)乳糖酶制劑作為催化劑還會(huì)給牛奶中增加外來(lái)蛋白質(zhì)，反應(yīng)結(jié)束后需專(zhuān)門(mén)的工藝對(duì)酶進(jìn)行分離，這些原因使乳糖酶的應(yīng)用受到了限制。
[0005]中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)CN1724662A公開(kāi)了一種乳糖酶的固定化方法及固定化乳糖酶的應(yīng)用，利用樹(shù)脂作為載體采用吸附和交聯(lián)法固定化乳糖酶，盡管實(shí)現(xiàn)了催化劑的多次利用，但是孔道中酶的存在影響了底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散，對(duì)反應(yīng)的高效發(fā)生產(chǎn)生了不利影響。
[0006]中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)CN101845431A公開(kāi)了一種固定化乳糖酶及其制備方法與應(yīng)用，其中的催化劑是利用帶有氨基基團(tuán)的載體經(jīng)戊二醛處理制成活化載體，然后再固定乳糖酶制備而成。盡管固定化酶性能達(dá)到了要求，但載體的特殊性質(zhì)要求限制了該方法的進(jìn)一步發(fā)展，而且利用戊二醛交聯(lián)后未考慮反應(yīng)不完全的戊二醛會(huì)對(duì)后續(xù)反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生不利影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種多層級(jí)固定化乳糖酶的制備方法，該方法化學(xué)物質(zhì)殘留少，所制得的乳糖酶的催化活性好、利用率高。
[0008]本發(fā)明的另一目的是提供一種用本發(fā)明的方法制得的多層級(jí)固定化乳糖酶制備低聚半乳糖的方法。
[0009]為此，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0010]1、一種多層級(jí)固定化乳糖酶的制備方法，包括以下步驟:
[0011]I)多層級(jí)介孔硅材料的合成，包括以下步驟:
[0012]A.在20?40°C條件下，將0.5?4g三嵌段共聚物溶解于150ml、0.5?2M的鹽酸中，然后加入0.5?3g均三甲苯，并于室溫?cái)嚢鐸?8h ;
[0013]B.將步驟A所得溶液升溫至40 °C，加入5?20g硅前驅(qū)體，連續(xù)攪拌12?48h后，于100 °C密封靜置老化12?48h ;
[0014]C.將固相和液相分離，然后將分離后的固相于400_600°C碳化I?6h，得到多層級(jí)介孔娃材料；
[0015]2)固定化乳糖酶的制備:取10mg制得的多層級(jí)介孔娃材料，與2ml、濃度為80-150mg/ml的乳糖酶液混合，在150_300r/min的轉(zhuǎn)速下，振蕩吸附0.5_3h，得到多層級(jí)固定化乳糖酶粗品；
[0016]3)洗滌:用濃度為0.01-0.5M、pH值為7.0-10.0的磷酸緩沖液多次沖洗所述多層級(jí)固定化乳糖酶粗品后，得到多層級(jí)固定化乳糖酶。
[0017]優(yōu)選的是，在所述步驟2)的振蕩吸附完成后，還進(jìn)行多層級(jí)固定化乳糖酶粗品的再處理，具體為:將多層級(jí)固定化乳糖酶粗品浸沒(méi)于0.1-2.0% (v/v)的戊二醛中，在150-300r/min的轉(zhuǎn)速下，連續(xù)振蕩0.5_3h，使乳糖酶分子通過(guò)戊二醛交聯(lián)在一起，再用濃度為0.01-0.5M、pH值為7.0-10.0的磷酸緩沖液洗滌沉淀，然后將洗滌后的沉淀置于濃度為0.01-0.5M、pH值為7.0-10.0的Tris-HCl浸泡液中振蕩反應(yīng)0.5h。與戊二醛的交聯(lián)雖然會(huì)對(duì)酶的活性有些傷害，但能夠有效提高固定化酶的穩(wěn)定性，尤其是提高重復(fù)多次使用后的廣品廣率。
[0018]在步驟I)中，所述三嵌段共聚物為P123或F127。
[0019]在步驟2)中，所述硅前驅(qū)體為正硅酸甲酯或1，2_ 二(三乙氧基硅基)乙烷。
[0020]在步驟3)中，用濃度為0.01-0.5M、pH值為7.0-10.0的磷酸緩沖液進(jìn)行洗滌的次數(shù)為3-5次，每次洗滌5min。優(yōu)選的是，所述磷酸緩沖液的濃度為0.1M、pH值為7.0。
[0021]一種上述的制備方法制得的多層級(jí)固定化乳糖酶，由載體和乳糖酶分子構(gòu)成，所述載體為硅前驅(qū)體脫水縮合而成的多層結(jié)構(gòu)，在層與層之間形成有空隙，且每層結(jié)構(gòu)上形成有多個(gè)直徑為2-50nm通孔；所述乳糖酶分子存在于所述層與層之間的空隙內(nèi)并借助戊二醛彼此連接在一起。
[0022]一種用上述制備方法制得的多層級(jí)固定化乳糖酶合成低聚半乳糖的方法，具體為:在20?60°C下，將乳糖溶解于濃度為0.01-0.5M、pH 4.0?10.0的磷酸緩沖液中，使乳糖的濃度為30-60wt%，然后加入多層級(jí)固定化酶，振蕩反應(yīng)2-7h，制得低聚半乳糖，其中所述多層級(jí)固定化酶的加入量為6-25g/25ml溶液。
[0023]優(yōu)選的是，所述反應(yīng)的溫度為45°C，磷酸緩沖液的濃度為0.1M、pH值為6.0，所述乳糖在磷酸緩沖液中的濃度為50wt%，所述多層級(jí)固定化酶的用量為20.0g/25ml溶液，振蕩反應(yīng)時(shí)間為4h ;優(yōu)選的是，在反應(yīng)體系中還加入2mmol/L的Mg2+。
[0024]本發(fā)明通過(guò)合成一款如洋蔥般的多層級(jí)介孔硅材料，將乳糖酶分子吸附于各層之間的空隙后，利用交聯(lián)劑使乳糖酶分子交聯(lián)，在保證多層級(jí)介孔硅材料每層孔道暢通的前提下，實(shí)現(xiàn)酶的高效固定化。另外，通過(guò)簡(jiǎn)單的措施對(duì)反應(yīng)不完全的交聯(lián)劑進(jìn)行處理，降低其對(duì)后續(xù)催化過(guò)程的不利影響，保障固定化酶的高催化活性和穩(wěn)定性。
[0025]除乳糖酶外，本方法還適用于其他酶類(lèi)分子，只需根據(jù)不同酶的分子大小，適當(dāng)改變個(gè)別參數(shù)，使酶分子能夠通過(guò)每層表面的孔道并被吸附于層與層間的空隙即可。
【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1是本發(fā)明的方法制得的多層級(jí)固定化乳糖酶的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的多層級(jí)固定化乳糖酶的制備方法進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0028]實(shí)施例1:
[0029]在25°C條件下，將4g P123(PE020-PP070-PE020，聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷-聚環(huán)氧乙烷三嵌段共聚物)溶解于150ml、1.6M的鹽酸中，然后加入2g均三甲苯(TMB)并于室溫?cái)嚢?h。然后將所得溶液升溫至40°C，加入8.5g正硅酸甲酯(TEOS)并連續(xù)攪拌20h，再于100°C密封靜置老化24h。之后過(guò)濾，將固相于550°C碳化4h，得到多層級(jí)介孔硅材料。
[0030]將10mg多層級(jí)介孔娃材料與2ml、濃度為100mg/ml的乳糖酶液混合并在200r/min的轉(zhuǎn)速下，振蕩吸附lh，然后離心分離，所得多層級(jí)固定化乳糖酶粗品的酶載量為85mg酶蛋白/g載體。
[0031]將多層級(jí)固定化乳糖酶粗品浸沒(méi)于0.5% (V/V)的戊二醛中，在200r/min的轉(zhuǎn)速下連續(xù)振蕩lh，促使氨基與醛基充分反應(yīng)。然后用0.1Μ、ρΗ為7.0的磷酸緩沖液洗滌沉淀，去除過(guò)量戊二醛和未交聯(lián)的游離酶。之后將洗滌后的沉淀置于0.1Μ、ρΗ為7.0的Tris-HCl浸泡液中，在200r/min的轉(zhuǎn)速下振蕩反應(yīng)0.5h。
[0032]最后，用0.02M、pH為7.0的磷酸緩沖液洗滌5次，每次5min，得到多層級(jí)固定化乳糖酶成品。
[0033]多層級(jí)固定化乳糖酶的結(jié)構(gòu)如圖1所示，多層級(jí)介孔硅材料3具有類(lèi)似洋蔥的層狀結(jié)構(gòu)，但其