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      一種高通量快速提取蔬菜單粒種子dna的方法

      文檔序號:8523838閱讀:516來源:國知局
      一種高通量快速提取蔬菜單粒種子dna的方法
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域,涉及模板DNA的制備方法,是一種高效、快速、 低成本、操作簡便的高通量蔬菜單粒種子DNA提取方法。
      【背景技術(shù)】
      [0002] 分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)滲透到生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、植物學(xué)、遺傳學(xué)和動物學(xué)等各個方面。 植物DNA的提取是進行分子分析的最基本步驟,在植物基因工程以及植物分子生物學(xué)研究 中占有重要地位,所提取出的DNA質(zhì)量的好壞將直接關(guān)系到后期分子生物學(xué)試驗研究的成 敗?;赑CR技術(shù)的分子標(biāo)記已廣泛地運用于種子純度鑒定、親緣關(guān)系的分析、分子標(biāo)記輔 助育種、基因定位以及轉(zhuǎn)基因植株檢測等。其中以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的標(biāo)記如簡單重復(fù)序列 標(biāo)記(SSR標(biāo)記或微衛(wèi)星標(biāo)記),由于其具有多態(tài)性好、可靠性高、技術(shù)簡單、價格便宜和DNA 模板使用量低等優(yōu)點,在分子生物學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用。長期以來,單粒種子樣本中DNA 的提取一直是耗時、繁瑣的過程,嚴(yán)重減慢了檢測速度。因此,許多學(xué)者一直在探索蔬菜單 粒種子DNA的高通量快速提取方法。
      [0003] 目前國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)并使用的DNA提取方法有很多,主要有傳統(tǒng)法、螯合樹脂法、 磁珠法、免疫親合法等。
      [0004] (1)傳統(tǒng)法通過CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)或SDS (十二烷基硫酸鈉)裂解細 胞,酚/氯仿等有機溶劑抽提蛋白,能夠有效地去除多糖及酚類物質(zhì)的沉淀,因而適用于從 含酚類及糖類物質(zhì)較高的植物材料中提取DNA,獲得的DNA純度高,含量多。但比較費時,需 要5小時甚至更多,流程繁瑣,同時樣品需要4-5個EP管,容易造成混淆和污染,操作復(fù)雜。 而且提取過程中使用了大量的有機溶劑,有損實驗人員的健康。
      [0005] (2)磁珠法靠磁珠吸附、磁場分離提取DNA,適用于冰凍、陳舊組織,簡單、快速整個 過程僅需不到2小時,利用磁場分離可以得到較純的DNA,但產(chǎn)量比傳統(tǒng)法獲得的少,且成 本較高。
      [0006] (3)免疫親合法通過抗原抗體反應(yīng)來提取DNA,適用于樣本含量很少的標(biāo)本,獲得 的DNA純度高,含量多。缺點是設(shè)備要求比較高,不易普及,而且抗DNA單克隆抗體制備是 關(guān)鍵步驟。
      [0007] (4)螯合樹脂法使用Chelex-100樹脂來提取DNA,據(jù)報道該方法目前用于細菌、血 液及部分病毒核酸提取,操作簡單、快速、且成本不高。同時避免使用酚氯仿等有機溶劑,對 操作人員沒有損害。
      [0008] Chelex-100是一種化學(xué)整合樹脂,由苯乙烯、二乙烯苯共聚體組成。含有成對的 亞氨基二乙酸鹽離子,整合多價金屬離子,尤其是選擇性整合二價離子,比普通離子交換劑 具有更高的金屬離子選擇性和較強的結(jié)合力.能結(jié)合許多可能影響一步分析的其他外源 物質(zhì)。通過離心除去Chelex-100顆粒,使這些與Chelex-100結(jié)合的物質(zhì)與DNA分離,防 止結(jié)合到Chelex中的抑制劑或雜質(zhì)帶到PCR反應(yīng)中,影響下一步的DNA分析,并通過結(jié)合 金屬離子,防止DNA降解,并提高PCR擴增成功率。1989年Singer. Sam等最先報導(dǎo)了用 Chelex-100法提取組織培養(yǎng)細胞DNA,1991年Walsh等系統(tǒng)的研究了該方法在多種法醫(yī)生 物檢材中的具體應(yīng)用。目前Chelex-100法已經(jīng)逐漸擴展到其他學(xué)科,用此法提取的DNA操 作簡便,并可以減少提取過程中DNA的損失,常用于十分微量的樣品中(如毛發(fā)、血液、精斑 和上皮脫落細胞中等)中提取足量的DNA。本發(fā)明利用Chelex-100對單粒種子破殼發(fā)育至 初期幼苗的新鮮單株樣品進行高通量快速提取,提高了育種產(chǎn)業(yè)品種選育和純度鑒定過程 的檢測效率。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0009] 本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)樣本DNA提取步驟多、復(fù)雜、費時等缺點,公開了一種 高通量快速提取蔬菜單粒種子DNA的方法。本發(fā)明的DNA提取方法具有高效、快速、低成本、 操作簡便等優(yōu)勢。
      [0010] 為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案:
      [0011] 一種高通量快速提取蔬菜單粒種子DNA的方法,其特征在于它按如下步驟進行:
      [0012] (1)取待測植物樣本l〇〇mg加入1. 5mL滅菌離心管中,利用手持式電動破碎儀研磨 至粉末;
      [0013] (2)加入100 ii L10%Chelex_100溶液,渦旋充分混勻,置于65°C水浴鍋中恒溫水浴 20min;
      [0014] (3)水浴后迅速冰上冷凍lOmin,13200rpm/min,離心3min,取上清,保存,用于后 續(xù)PCR擴增。
      [0015] 本發(fā)明所述的待測樣本為植物樣品包括花椰菜、大白菜、黃瓜、芹菜等各類蔬菜植 物樣品。本發(fā)明所述的待測樣本為植物種子破殼發(fā)育至初期幼苗的新鮮單株樣品。
      [0016] 本發(fā)明所述的Chelex-100溶液濃度為10%,加入量為100 i! L ;恒溫水浴溫度為 65°C,時間為20min ;離心速度為13200rpm/min,時間為3min。
      [0017] 為了能更加清楚的說明本發(fā)明的提取方法,下面以大白菜為樣本實例,對本發(fā)明 的提取方法與傳統(tǒng)的CTAB法分別加以比較對照說明。
      [0018] 一、材料和方法
      [0019] (1)樣品:大白菜雜交種,由天津科潤蔬菜研究所提供。
      [0020] (2)主要儀器:高速冷凍離心機,PCR擴增儀,恒溫水浴鍋,凝膠電泳設(shè)備。
      [0021] (3)主要試劑:
      [0022] EST-PCR引物由上海生工公司合成,引物序列見表1。
      [0023] 2 X GoTaq.li: Master Mixes 試劑購自 Promega 公司。
      [0024] Chelex-100 購自 sigma 公司。
      [0025] 10%Chelex_100溶液:稱量 10g Chelex-100,加入90mL去離子水,121°C滅菌,用時 混勻。
      [0026] CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)提取緩沖液:1000mL水中溶解CTAB20g, Trisl2. llg,NaC181. 82g,Na2EDTA7. 44g,高壓滅菌。
      [0027] 表1大白菜純度鑒定EST-SSR引物序列
      [0028]
      [0029] 二、大白菜雜交種DNA的兩種提取方法的比較
      [0030] 1、CTAB 法提取 DNA
      [0031] (1)取大白菜雜交種單株幼苗約l〇〇mg,利用手持式電動破碎儀研磨至粉末;
      [0032] (2)加入800 ii L預(yù)熱至65°C的CTAB提取緩沖液,充分混合,65°C水浴60min,期間 不停顛倒混勻;
      [0033] (3) 13200rpm/min離心10min,轉(zhuǎn)移上清至一新離心管,加入500 y L的氯仿異戊 醇,充分混勻,13200rpm/min離心10min,轉(zhuǎn)移上清至一新離心管;重復(fù)1次;
      [0034] (4)加入2倍體積的CTAB沉淀緩沖液,混勻,室溫靜置60min ;13200rpm/min離心 lOmin,棄上清;
      [0035] (5)沉淀中加入350 y L氯化鈉溶液溶解沉淀,再加入350 y L氯仿異戊醇,充分混 勻,13200rpm/min離心10min,轉(zhuǎn)移上清至一新離心管;
      [0036] (6)加入0? 6倍體積異丙醇,混勻,13200rpm/min離心10min,棄上清;
      [0037] (7)沉淀中加入500 y L70%乙醇溶液,13200rpm/min離心10min,棄上清;重復(fù)1 次;干燥沉淀,加入100 y L滅菌去離子水溶解DNA。
      [0038]2、本發(fā)明方法提取DNA
      [0039] (1)取大白菜雜交種單株幼苗約lOOmg加入1. 5mL滅菌離心管中,利用手持式電動 破碎儀研磨至粉末;
      [0040] (2)加入100 ii L10%Chelex_100溶液,渦旋充分混勻,置于65°C水浴鍋中恒溫水浴 20min;
      [0041] (3)水浴后迅速冰上冷凍lOmin,13200rpm/min,離心3min,取上清,保存,用于后 續(xù)PCR擴增。
      [0042] 三、兩種方法提取DNA的PCR擴增檢測試驗:
      [0043] 1、PCR反應(yīng)體系組成:
      [0044] 2X 〇〇丁叫? Master Mixes5 ii L,上游和下游引物 10μmol/L 各 0? 25 ii L,供試品 種大白菜基因組DNA模板,濃度50ng/ y L,1 y L,雙蒸水補足10 y L ;
      [0045] 2、PCR反應(yīng)程序:
      [0046] 94°C預(yù)變性 5min,35 個擴增循環(huán)(94°C lmin,53. 5°C 45sec,72°C 45sec) ;72°C延 伸7min,4°C保存;
      [0047] 3、產(chǎn)物鑒定:8%非變性聚丙烯凝膠電泳
      [0048] 電泳條件,電壓:250V ;時間:30min。
      [0049] 銀染觀察,用20bp Marker做分子量標(biāo)記。
      [0050] 4、PCR擴增結(jié)果:
      [0051] 對兩種方法提取的DNA,分別進行大白菜純度鑒定引物BC1、BC9、BC26的擴增,非 變性聚丙烯凝膠電泳結(jié)果見附圖。結(jié)果顯示,兩種方法提取DNA的擴增結(jié)果是基本一致的。
      [0052] 本發(fā)明與傳統(tǒng)技術(shù)相比具有的積極效果在于:
      [0053] (1)傳統(tǒng)DNA提取操作步驟多、復(fù)雜、費時。需要經(jīng)過裂解、抽提等多個步驟,同時 需要在多個離心管之間相互轉(zhuǎn)移樣本,增加了對樣本間交叉污染的可能性。另外,氯仿等有 機溶劑對人體有害。而本發(fā)明的DNA提取方法過程簡便、整個提取過程在同一離心管中即 可完成,同時無需使用有毒有機溶劑,對人體和環(huán)境都不會造成危害。
      [0054] (2)本方法最大的優(yōu)點在于其過程快速,簡便,充分提高了育種產(chǎn)業(yè)品種鑒定和純 度鑒定的檢測效率。與傳統(tǒng)的提取過程需要5小時左右相比,采用本方法,35min就可以完 成樣本DNA提取的全過程。
      [0055] (3 )采用本發(fā)明的快速提取樣本DNA的方法所得到的DNA經(jīng)PCR檢測實驗,證實與 傳統(tǒng)方法得到的DNA基本一致,完全可以采用此方法替代復(fù)雜、費時的傳統(tǒng)CTAB法,從而大 大節(jié)省了時間。
      【附圖說明】:
      [0056] 圖1為EST-SSR引物BC1用于大白菜品種擴增產(chǎn)物的電泳分析圖譜;自左向右依 次為大白菜品種"秋綠75"、大白菜品種"津秋78"(傳統(tǒng)CTAB法);大白菜品種"秋綠75"、 大白菜品種"津秋78"(本發(fā)明方法);
      [0057] 圖2為EST-SSR引物BC9用于大白菜品種擴增產(chǎn)物的電泳分析圖譜;自左向右依 次為大白菜品種"秋綠75"、大白菜品種"秋綠60"(傳統(tǒng)CTAB法);大白菜品種"秋綠75"、 大白菜品種"秋綠60"(本發(fā)明方法);
      [0058] 圖3為EST-SSR引物BC26用于大白菜品種擴增產(chǎn)物的電泳分析圖譜;自左向右依 次為大白菜品種"秋綠75"、大白菜品種"津秋78"(傳統(tǒng)CTAB法);大白菜品種"秋綠75"、 大白菜品種"津秋78"(本發(fā)明方法);
      [0059] 圖4為花椰菜EST-SSR引物HYC33擴增產(chǎn)物的電泳分析圖譜;自左向右依次為1-5 為本發(fā)明方法提取DNA的母本05H2擴增產(chǎn)物;6-25為本發(fā)明方法提取DNA的20株"津品 70" F1代雜交
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