[0029] 1、選擇性更好。本發(fā)明選擇性能優(yōu)越，可以在大量非待檢測核酸變異體中檢測到 微量的待檢測核酸變異體。傳統(tǒng)的等位基因特異性PCR的方法，使用3'末端錯配的引物一 旦錯誤的延伸就相當(dāng)于人為的引入突變型的變異體，這種人為引入的突變型變異體在隨后 的每一輪循環(huán)中被作為突變型變異體被擴(kuò)增，而本發(fā)明不存在這一問題。在本發(fā)明中，即使 非待檢測變異體在PCR-輪反應(yīng)中得到了擴(kuò)增，但是擴(kuò)增產(chǎn)物在下一輪反應(yīng)中仍然容易形 成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而無法高效擴(kuò)增，從而高效的抑制了非待檢測變異體的擴(kuò)增效率，實(shí)現(xiàn)選擇性 擴(kuò)增。
[0030] 2、引物設(shè)計簡單，操作方便。
[0031] 3、應(yīng)用廣泛，本發(fā)明可廣泛的應(yīng)用于核酸擴(kuò)增，腫瘤體外診斷，基因分型等領(lǐng)域。
【附圖說明】
[0032] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以 根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0033] 圖1為發(fā)夾結(jié)構(gòu)示意圖；
[0034] 圖2為利用本發(fā)明寡聚核苷酸片段實(shí)現(xiàn)選擇性擴(kuò)增的技術(shù)原理示意圖；
[0035] 圖3為本發(fā)明寡聚核苷酸片段對EGFR G719S選擇性擴(kuò)增結(jié)果示意圖；
[0036] 圖4為本發(fā)明寡聚核苷酸片段對EGFR T790M選擇性擴(kuò)增結(jié)果示意圖；
[0037] 圖5為本發(fā)明寡聚核苷酸片段對混合模板選擇性擴(kuò)增結(jié)果示意圖；
[0038] 圖6為本發(fā)明寡聚核苷酸片段及MGB探針實(shí)現(xiàn)選擇性擴(kuò)增與選擇性檢測示意圖；
[0039] 圖7為不含核酸雙鏈穩(wěn)定因子的本發(fā)明寡聚核苷酸片段擴(kuò)增結(jié)果示意圖；
[0040]圖8為包含核酸雙鏈穩(wěn)定因子的本發(fā)明寡聚核苷酸片段擴(kuò)增結(jié)果示意圖；
[0041]圖9為本發(fā)明的寡聚核苷酸片段對缺失突變的選擇性擴(kuò)增結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 為了檢測存在于大量非待檢測核酸變異體中的少量待檢測核酸變異體，發(fā)明人進(jìn) 行了大量的研宄工作，并提出了本發(fā)明技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng) 改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是 顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述， 相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變 更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0043] -方面，本發(fā)明提供一種選擇性擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列變異體的方法，該方法包括：采 用至少含有一個寡聚核苷酸片段擴(kuò)增待檢測樣品，該樣品中可能含有一種或多種變異體。 該寡聚核苷酸片段包含引物區(qū)和變異體識別區(qū)，引物區(qū)在3'端，變異體識別區(qū)在5'端，兩 者之間共價相連。在合適的反應(yīng)體系中，引物區(qū)與目的核酸序列進(jìn)行雜交，引物區(qū)的3'末 端被核酸聚合酶延伸。當(dāng)目的核酸序列的非待檢測變異體作為模板時，變異體識別區(qū)與引 物區(qū)延伸產(chǎn)生的序列完全互補(bǔ)配對或部分互補(bǔ)配對，形成一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)，如圖1所示。
[0044] 當(dāng)待檢測核酸變異體作為模板時，變異體識別區(qū)與引物區(qū)延伸產(chǎn)生的序列不完全 匹配，無法形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。上述形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)不適宜作為下一輪擴(kuò)增的模板，抑制 了擴(kuò)增效率，導(dǎo)致非待檢測變異體的擴(kuò)增遭到了相較于待檢測變異體更大的抑制，從而實(shí) 現(xiàn)選擇性擴(kuò)增，如圖2所示。
[0045] 在一些實(shí)施例中，變異體識別區(qū)共價連接有核酸雙鏈穩(wěn)定因子。雙鏈穩(wěn)定因子可 以提高發(fā)夾結(jié)構(gòu)的頸部的退火溫度，起到穩(wěn)定發(fā)夾結(jié)構(gòu)的作用。在一些實(shí)施例中，變異體識 別區(qū)含有不能被核酸酶水解的修飾，包括堿基類似物的修飾，核酸骨架的修飾，脫氧核糖類 似物的修飾，包括但不局限于肽核酸，硫代磷酸酯等。這些修飾可以防止該寡聚核苷酸片段 被核酸酶水解，使得發(fā)夾結(jié)構(gòu)不被破壞。
[0046] 在一些實(shí)施方式中，與變異體識別區(qū)直接或者通過其他基團(tuán)共價相連的核酸雙鏈 穩(wěn)定因子連接在該寡聚核苷酸片段的5'端的核苷酸上。其中，核酸雙鏈穩(wěn)定因子可以是鎖 核酸，肽核酸或者DNA小溝結(jié)合物及其類似物等。
[0047] 在一些實(shí)施例中，結(jié)合使用一種核酸檢測的方法，包括不區(qū)分核酸變異體的核酸 檢測方法，也包括區(qū)分不同核酸變異體的檢測方法。不區(qū)分核酸變異體的核酸檢測方法包 括染料法、雜交探針檢測法、水解探針檢測法、Taqman探針法或分子信標(biāo)法。區(qū)分不同核酸 變異體的檢測方法包括測序法或高分辨率熔解曲線法，或者結(jié)合使用區(qū)分不同核酸變異體 的雜交探針、區(qū)分不同核酸變異體的水解探針、區(qū)分不同核酸變異體的Taqman探針或區(qū)分 不同核酸變異體的分子信標(biāo)的方法。
[0048] 在一些實(shí)施例中，合適的反應(yīng)體系是一種隨溫度升高而啟動反應(yīng)的體系。這種隨 溫度升高而啟動反應(yīng)的體系可以提高反應(yīng)的特異性。
[0049] 另一方面，本發(fā)明提供了一種寡聚核苷酸片段，它由引物區(qū)和變異體識別區(qū)組成， 兩者之間共價相連。當(dāng)變異體識別區(qū)與引物區(qū)的延伸產(chǎn)生的序列完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ)時， 形成了一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)。所述變異體識別區(qū)共價連接有核酸雙鏈穩(wěn)定因子或者含有不能被核 酸酶水解的修飾，包括堿基類似物的修飾，核酸骨架的修飾，脫氧核糖類似物的修飾，包括 但不局限于肽核酸，硫代磷酸酯等。其中，核酸雙鏈穩(wěn)定因子可以是鎖核酸，肽核酸或者DNA 小溝結(jié)合物及其類似物等。寡聚核苷酸片段的變異體識別區(qū)直接或者通過其他基團(tuán)共價相 連的核酸雙鏈穩(wěn)定因子連接在該寡聚核苷酸片段的5'端的核苷酸上。
[0050] 另一方面，本發(fā)明提供了一種檢測核酸變異體的試劑盒，該試劑盒包括前述寡聚 核苷酸片段，該片段包含引物區(qū)和變異體識別區(qū)，兩者之間共價相連。當(dāng)變異體識別區(qū)與 引物區(qū)的延伸產(chǎn)生的序列完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ)時，形成了一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)。所述變異體識別 區(qū)共價連接有核酸雙鏈穩(wěn)定因子或者含有不能被核酸酶水解的修飾，包括堿基類似物的修 飾，核酸骨架的修飾，脫氧核糖類似物的修飾，包括但不局限于肽核酸，硫代磷酸酯等。其 中，核酸雙鏈穩(wěn)定因子可以是鎖核酸，肽核酸或者DNA小溝結(jié)合物及其類似物等。該試劑盒 還包括合適的試劑盒擴(kuò)增體系，如包括核酸聚合酶延伸所需要的核酸聚合酶、二價金屬離 子、核苷酸、鹽、緩沖劑及其他輔助因子等。此外該試劑盒還包括核酸檢測所需的試劑，包括 但不限于核酸染料、探針等中的一種或幾種。
[0051] 本發(fā)明寡聚核苷酸片段至少包含引物區(qū)和變異體識別區(qū)，兩者之間可以共價相 連，當(dāng)引物區(qū)與其互補(bǔ)的靶核酸完全互補(bǔ)時，在合適的核酸聚合酶延伸體系中，核酸聚合酶 利用核苷酸為原料延伸引物區(qū)。"互補(bǔ)"指的是寡聚核苷酸片段與其靶核酸通過氫鍵形成堿 基對，包括A腺嘌呤與T胸腺嘧啶或者U尿嘧啶，C胞嘧啶與G鳥嘌呤之間形成的堿基對， 也包括一些自然或者非自然的核苷酸類似物參與形成的氫鍵。例如，5-溴尿嘧啶與胸腺嘧 啶類似可以與腺嘌呤形成互補(bǔ)堿基對，但在其烯醇形式下可以和鳥嘌呤一起形成互補(bǔ)堿基 對。設(shè)計的本專利提及的寡聚核苷酸片段、及其它引物和探針見表1。
[0052] 表1設(shè)計的寡聚核苷酸片段、及其它引物和探針
[0053]
[(
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 寡聚核苷酸片段，其特征在于： 包含以共價相連的引物區(qū)和變異體識別區(qū)，引物區(qū)在3'端，變異體識別區(qū)在5'端，所 述變異體識別區(qū)共價連接有核酸雙鏈穩(wěn)定因子或含有不能被核酸酶水解的修飾因子，所述 變異體識別區(qū)與所述引物區(qū)延伸產(chǎn)生的序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
2. 如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸片段，其特征在于：所述修飾因子包括堿基類似物、 核酸骨架、脫氧核糖類似物、肽核酸或硫代磷酸酯。
3. 如權(quán)利要求1所述寡聚核苷酸片段，其特征在于：所述的核酸雙鏈穩(wěn)定因子包括鎖 核酸、肽核酸或DNA小溝結(jié)合物/類似物中的一種或一種以上的組合。
4. 如權(quán)利要求1所述寡聚核苷酸片段，其特征在于：核酸雙鏈穩(wěn)定因子與變異體識別 區(qū)直接連接、或者通過共價相連。
5. -種選擇性擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列變異體的方法，采用權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的寡 聚核苷酸片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，該方法包括： ⑴將所述寡聚核苷酸片段中引物區(qū)與目標(biāo)核酸序列在反應(yīng)體系中進(jìn)行雜交，為擴(kuò)增準(zhǔn) 備模板； ⑵在擴(kuò)增體系中，所述引物區(qū)的3'末端被核酸聚合酶延伸； ⑶以所述待檢測樣品中的變異體作為模板時，寡聚核苷酸片段變異體識別區(qū)與引物區(qū) 延伸，產(chǎn)生的序列無法形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行， 以所述待檢測樣品中的非待檢測核酸變異體作為模板時，寡聚核苷酸片段變異體識別 區(qū)與引物區(qū)延伸，產(chǎn)生的序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，擴(kuò)增反應(yīng)被抑制。
6. 如權(quán)利要求5所述的選擇性擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列變異體的方法，其特征在于：結(jié)合使 用一種不區(qū)分不同核酸變異體的檢測方法，包括染料法、雜交探針檢測法、水解探針檢測 法、Taqman探針法或分子信標(biāo)法。
7. 如權(quán)利要求5所述的選擇性擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列變異體的方法，其特征在于：結(jié)合使 用一種區(qū)分不同核酸變異體的方法，包括測序法或高分辨率熔解曲線法，或者結(jié)合使用區(qū) 分不同核酸變異體的雜交探針、區(qū)分不同核酸變異體的水解探針、區(qū)分不同核酸變異體的 Taqman探針或區(qū)分不同核酸變異體的分子信標(biāo)的方法。
8. 如權(quán)利要求5所述的選擇性擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列變異體的方法，其特征在于：所述擴(kuò) 增體系是一種隨溫度升高而啟動反應(yīng)的體系。
9. 一種用于檢測核酸變異體的試劑盒，采用權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的寡聚核苷酸 片段檢測所述核酸變異體。
10. 如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括核酸檢測所需的試 劑，所述核酸檢測所需的試劑包括核酸染料和/或探針。
11. 如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括試劑盒擴(kuò)增體系，所 述試劑盒擴(kuò)增體系包括核酸聚合酶、二價金屬離子、核苷酸、鹽、緩沖劑或輔助因子中的一 種或多種組合。
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種選擇性擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列變異體的方法。通過采用一種特殊結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸片段，該片段分為引物區(qū)和變異體識別區(qū)。當(dāng)非待檢測核酸變異體作為模板時，變異體識別區(qū)與引物區(qū)延伸產(chǎn)生的序列，形成一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)；當(dāng)待檢測變異體作為模板時，變異體識別區(qū)與引物區(qū)延伸產(chǎn)生的序列無法形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。上述發(fā)夾結(jié)構(gòu)不適宜作為下一輪擴(kuò)增的模板，抑制了擴(kuò)增效率，待檢測變異體由于無法形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，因此可以得到有效擴(kuò)增從而實(shí)現(xiàn)選擇性擴(kuò)增。
【IPC分類】C12N15-11, C12N15-10, C12Q1-68
【公開號】CN104845967
【申請?zhí)枴緾N201510305502
【發(fā)明人】畢萬里, 王志峰, 許鑫
【申請人】蘇州新海生物科技有限公司
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年6月4日