田鼠巴貝蟲Bm186抗原及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種寄生蟲田鼠巴貝蟲，具體來(lái)說(shuō)是一種田鼠巴 貝蟲Bml86抗原及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 1957年，南斯拉夫報(bào)道了首例人體巴貝蟲病的確診病例。隨后，歐洲多個(gè)國(guó)家和 美國(guó)相繼報(bào)道了多例人體巴貝蟲病，亞洲的日本、中國(guó)大陸和臺(tái)灣地區(qū)、非洲的南非和埃 及也出現(xiàn)了少量的病例。巴貝蟲病是由寄生于脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞的巴貝蟲感染引起，是一 種由蜱傳播的人獸共患病。目前，已被鑒定可導(dǎo)致人體巴貝蟲病的巴貝蟲，包括田鼠巴貝 蟲（Babesia microti)和分歧巴貝蟲（Babesia divergens)為主的等少數(shù)幾種巴貝蟲科 (Babesiidae)原蟲。
[0003] 人一般通過(guò)帶蟲蜱的叮咬或臨床輸入無(wú)癥狀感染者所獻(xiàn)血液導(dǎo)致感染。該病的臨 床癥狀表現(xiàn)不一，多為無(wú)癥狀的隱性感染，少數(shù)病例以發(fā)熱、溶血、貧血、脾腫大為主要臨床 表現(xiàn)，脾切除、年老和免疫功能低下者易罹患嚴(yán)重感染，甚至發(fā)生死亡。
[0004] 統(tǒng)計(jì)表明：美國(guó)近20年，以田鼠巴貝蟲為主的人體巴貝蟲病呈暴發(fā)流行趨勢(shì)。在 我國(guó)巴貝蟲病屬于新發(fā)寄生蟲病，近年來(lái)，時(shí)有人體感染病例報(bào)道。臨床醫(yī)生由于缺乏相關(guān) 認(rèn)知，該病易被忽視而導(dǎo)致嚴(yán)重后果。因此，建立快速、準(zhǔn)確的診斷方法是預(yù)防和控制巴貝 蟲病的重要手段。
[0005] 目前，田鼠巴貝蟲病的診斷技術(shù)主要包括病原、分子生物學(xué)和免疫學(xué)診斷技術(shù)。病 原診斷包括血液涂片顯微鏡檢查和動(dòng)物接種分離技術(shù)。鏡檢仍是診斷田鼠巴貝蟲病的金標(biāo) 準(zhǔn)，但在低密度原蟲血癥的情況下易漏診。動(dòng)物接種的方法敏感性高，但耗時(shí)（數(shù)周以上） 且昂貴，無(wú)法滿足快速檢測(cè)的需求。分子生物學(xué)技術(shù)是通過(guò)PCR方法擴(kuò)增田鼠巴貝蟲特異 性DNA片段，具有較高的敏感性和特異性，但對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備技術(shù)要求較高，另外，對(duì)無(wú)癥狀 感染者有時(shí)也無(wú)法得出陽(yáng)性結(jié)果。免疫學(xué)診斷技術(shù)中，間接免疫熒光試驗(yàn)作為目前唯一標(biāo) 準(zhǔn)化的田鼠巴貝蟲檢測(cè)方法，其應(yīng)用受特殊設(shè)備和專業(yè)人員操作的限制。ELISA方法近年來(lái) 也被用于田鼠巴貝蟲病的檢測(cè)，其中，BmSAl是目前文獻(xiàn)報(bào)道中診斷效果最好的抗原之一， 然而，其與惡性瘧原蟲存在一定的交叉反應(yīng)。因此，尋找診斷效果更好的田鼠巴貝蟲抗原是 提高ELISA檢測(cè)效果的關(guān)鍵。
[0006] 對(duì)已報(bào)道的田鼠巴貝蟲的診斷抗原進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)大部分抗原具有 完整或不完整的串聯(lián)重復(fù)多肽，并且為分泌性蛋白，即同時(shí)含有信號(hào)肽序列。如，BmP94、 BmIRA、BMNl-8、BmSAl、BMNl-17 和 BMN1-2 等抗原。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種田鼠巴貝蟲Bml86抗原及其應(yīng)用，所述的這種田鼠巴 貝蟲Bml86抗原及其應(yīng)用解決了現(xiàn)有技術(shù)中診斷田鼠巴貝蟲疾病的抗原及方法靈敏度不 高的技術(shù)問(wèn)題。
[0008] 本發(fā)明提供了一種分離的基因，其基因序列如SEQ ID NO :3所示。
[0009] 本發(fā)明提供了一種田鼠巴貝蟲Bm 186抗原蛋白，由上述的分離的基因所編碼，其 氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示。
[0010] 本發(fā)明提供了一種抗體，它特異性的結(jié)合上述的一種田鼠巴貝蟲Bml86抗原蛋 白。
[0011] 進(jìn)一步的，所述的抗體為單克隆抗體。
[0012] 本發(fā)明提供了一種載體，所述載體含有編碼上述的一種田鼠巴貝蟲Bml86抗原的 基因。
[0013] 本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞，所述的細(xì)胞含有上述的載體，或者所述的細(xì)胞用編 碼上述的一種田鼠巴貝蟲Bml86抗原的基因轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
[0014] 本發(fā)明提供了一種疫苗，包括上述的分離的基因、上述的一種田鼠巴貝蟲Bml86 抗原蛋白、或者上述的抗體、或者上述的載體。
[0015] 本發(fā)明提供了上述的分離的基因在制備治療、診斷或者預(yù)防田鼠巴貝蟲病的藥物 中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明提供了上述的田鼠巴貝蟲Bm 186抗原蛋白在制備治療、診斷或者預(yù)防田 鼠巴貝蟲病的藥物中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明提供了上述的抗體在制備治療、診斷或者預(yù)防田鼠巴貝蟲病的藥物中的應(yīng) 用。
[0018] 本發(fā)明提供了上述的疫苗在制備治療、或者預(yù)防田鼠巴貝蟲病的藥物中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明提供了一種試劑盒，含有上述的分離的基因、上述田鼠巴貝蟲Bm 186抗原 蛋白、或者上述的抗體。
[0020] 本發(fā)明提供了一種重組蛋白，含有SEQ ID NO :28或/和SEQ ID NO :29所示所示 的氨基酸序列。
[0021] 進(jìn)一步的，上述的一種重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :6、或者SEQ ID NO :8、 或者SEQ ID NO : 10所示。
[0022] 本發(fā)明提供了一種膠體金免疫層析試條，含有上述的重組蛋白。
[0023] 本發(fā)明提供了一種抗體，它特異性的結(jié)合上述的重組蛋白。
[0024] 本發(fā)明提供了一種試劑盒，含有上述的重組蛋白、或者上述的抗體。
[0025] 本文中的術(shù)語(yǔ)"載體"，是指本領(lǐng)域中常用的細(xì)菌質(zhì)粒、酵母質(zhì)粒及其它各種病毒 載體。本發(fā)明中適用的載體包括但不限于：在細(xì)菌中表達(dá)用的載體（原核表達(dá)載體）、在酵 母中表達(dá)用的載體（如畢赤酵母載體）、在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)用的載體（逆轉(zhuǎn)錄病毒載 體、腺病毒載體等）。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體為大腸桿菌表達(dá)載體。本領(lǐng)域技 術(shù)人員可利用DNA重組技術(shù)等一系列技術(shù)，構(gòu)建含本發(fā)明所述編碼融合蛋白的DNA序列、合 適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列、啟動(dòng)子及選擇性標(biāo)記基因等特定元件的表達(dá)載體。上述載體可 用來(lái)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞，以便獲得所需要的融合蛋白。
[0026] 本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，也可以是真核細(xì)胞，如，細(xì)菌細(xì)胞、哺乳動(dòng)物 細(xì)胞等。宿主細(xì)胞在轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染含本發(fā)明所述編碼融合蛋白的基因序列后，即構(gòu)成工程化 細(xì)胞或細(xì)胞株，可用于生產(chǎn)所需融合蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠恰當(dāng)?shù)剡x擇適當(dāng)?shù)妮d體、宿 主細(xì)胞，并熟知如何將載體高效地轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中，所用方法包括但不限于：氯化 鈣法、電穿孔法用于細(xì)菌細(xì)胞，脂質(zhì)體包裹、電融合法用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞等真核細(xì)胞。
[0027] 本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以通過(guò)常規(guī)方法培養(yǎng)、誘導(dǎo)來(lái)表達(dá)所需要的融合蛋白，包括 發(fā)酵過(guò)程和純化工藝。上述表達(dá)的蛋白可在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞膜上或分泌到細(xì)胞周質(zhì)、細(xì)胞外。 根據(jù)需要，可利用融合蛋白的物理的、化學(xué)的以及其它生物學(xué)特性，進(jìn)行分離純化。方法包 括但不限于：裂菌，離心，鹽析，分子篩色譜，離子交換色譜，吸附色譜，反向色譜，以及常規(guī) 的變性、復(fù)性處理等，這些方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
[0028] 本發(fā)明以串聯(lián)重復(fù)多肽和信號(hào)肽的雙重特征，搜索紅內(nèi)期的田鼠巴貝蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù) 據(jù)；同時(shí)通過(guò)免疫學(xué)方法鑒定，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的田鼠巴貝蟲抗原一Bml86。本發(fā)明為田鼠巴 貝蟲病的診斷提供了新技術(shù)和手段。通過(guò)田鼠巴貝蟲Bml86抗原的表達(dá)純化，已進(jìn)一步建 立了高特異性和敏感性的田鼠巴貝蟲病診斷初步方法；并易制備多/單克隆抗體，可應(yīng)用 于田鼠巴貝蟲的科研和防治等不同方面；本發(fā)明的疫苗具有預(yù)防田鼠巴貝蟲感染的效果。 本發(fā)明的試劑盒和膠體金免疫層析試條還可以用來(lái)檢測(cè)田鼠巴貝蟲。
【附圖說(shuō)明】：
[0029] 圖1為總RNA與mRNA瓊脂糖凝膠電泳圖，M :DNA標(biāo)志物，1 :總RNA，2 :mRNA。
[0030] 圖2為2組串聯(lián)重復(fù)序列示意圖，加框?yàn)榈谝唤M串聯(lián)重復(fù)序列，下劃線為第二組串 聯(lián)重復(fù)序列。
[0031] 圖3是信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果。
[0032] 圖4是Isotig00186的blastx序列比對(duì)分析圖。
[0033] 圖 5 是 Bml86 基因的 RTPCR 結(jié)果，M :DNA Marker ;1-3 :RTPCR 產(chǎn)物。
[0034] 圖6是Bml86蛋白的TMHMM分析結(jié)果。
[0035] 圖 7 是 pET28a-Bml86DST Rosetta2 (DE3)重組蛋白的表達(dá)鑒定。
[0036] 圖8是pET28a-Bml86DST Rosetta2(DE3)重組蛋白變性方式純化12%聚丙烯酰胺 凝膠電泳圖。
[0037] 圖9是pET28a-Bml86MT BL21 (DE3)重組蛋白的表達(dá)鑒定圖。
[0038] 圖10是口￡了28&-81111861〇'8121(0￡3)重組蛋白變性方式純化12%聚丙烯酰胺凝膠 電泳圖。
[0039] 圖11是pET28a-Bml86S BL21(DE3)重組蛋白的表達(dá)鑒定圖。
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