數(shù)X36/基因組長(zhǎng)度（Kb);病毒儲(chǔ)存液于-80°C凍 存。復(fù)制缺陷型Ad55載體的生產(chǎn)及純化結(jié)果如附圖5所示。
[0143] 實(shí)施例6 :復(fù)制缺陷型Ad55病毒在A549及293細(xì)胞中的復(fù)制能力鑒定。
[0144] 按照常規(guī)方法，以噬斑形成實(shí)驗(yàn)鑒定復(fù)制缺陷型Ad55載體在輔助細(xì)胞293 以及非輔助細(xì)胞A549中的生長(zhǎng)能力。六孔板中293或A549細(xì)胞長(zhǎng)至九成滿后，以 Ad55 A El A E3 (50rf6) -EGFP、Ad55 A El A E3 (5E4) -EGFP 以及 Ad55 A E3-EGFP 進(jìn)行感染，感 染滴度為lX107Vp/孔。感染后4小時(shí)，吸走培養(yǎng)基，并鋪上1 %的瓊脂糖凝膠（含1 %瓊脂 糖，5 %胎牛血清，1 X MEM培養(yǎng)基）。37 °C培養(yǎng)箱內(nèi)放置10-12天后，在熒光顯微鏡下觀察 病毒克隆的形成，并拍照記錄。結(jié)果如附圖6所示。Ad55AE3-EGFP保留完整的E1基因， 因此感染293及A549細(xì)胞后均可形成噬斑；而復(fù)制缺陷型Ad55 AE1 AE3(50rf6)-EGFP、 Ad55 A El A E3 (5E4) -EGFP僅能在293細(xì)胞中形成噬斑，在A549細(xì)胞中則不能形成噬斑。這 表明，復(fù)制缺陷型Ad55載體可在293細(xì)胞中有效增殖，但在正常人體細(xì)胞如A549細(xì)胞中不 具備復(fù)制能力，具有減毒表型。同時(shí)，該結(jié)果也顯示復(fù)制缺陷型人55型腺病毒載體可攜帶 報(bào)告基因進(jìn)入靶細(xì)胞，因而可應(yīng)用于報(bào)告示蹤系統(tǒng)中。
[0145] 實(shí)施例7 :復(fù)制缺陷型Ad55載體在小鼠中免疫原性的評(píng)估。
[0146] 按照附圖7所示的免疫方案，對(duì)復(fù)制缺陷型Ad55的免疫原性進(jìn)行了評(píng)估。
[0147] 6-8周齡Balb/c小鼠分為5組，每組5只；第0天，分別肌注免疫熱滅活的 Ad55 A E3-EGFP、Ad55 A E3-EGFP、Ad55 A El A E3 (50rf6) -EGFP、Ad55 A El A E3 (5E4) -EGFP、 Ad5 A El A E3 ;第21天，眼眶取血并分離血清；同時(shí)按上述方案加強(qiáng)免疫；第35天，眼眶取 血并分離血清；第42天，以Ad55 A E3-SEAP尾靜脈注射攻毒，劑量為2X 101(Vp/只；第44 天，取血并分離血清。最后，測(cè)定攻毒前血清中的抗Ad55中和抗體以及攻毒后血清中SEAP 的表達(dá)量。
[0148] 按照常規(guī)方法，以Ad55 A E3-SEAP及Ad5-SEAP作為報(bào)告病毒檢測(cè)小鼠血清中抗 Ad55、Ad5的中和抗體。293細(xì)胞鋪至96孔板，小鼠血清以無(wú)酚紅無(wú)血清培養(yǎng)基梯度稀釋?zhuān)?分別以lX10 7Vp的Ad55 A E3-SEAP及Ad5-SEAP與血清共孵育，37°C 1小時(shí)后加至細(xì)胞培養(yǎng) 板；繼續(xù)孵育24小時(shí)后，每孔取50微升培養(yǎng)上清，加至96孔黑色板；以phospha-light? system (Applied Biosystem)進(jìn)行檢測(cè)，在焚光照度計(jì)上讀取發(fā)光值；根據(jù)讀數(shù)計(jì)算中和抗 體的滴度。小鼠體內(nèi)中和抗體滴度如圖7所示，免疫組小鼠在初免后即可產(chǎn)生Ad55中和 抗體；而加強(qiáng)后抗體水平顯著提升；滅活A(yù)d55免疫產(chǎn)生的中和抗體滴度相對(duì)其他組較低； Ad55 AE1 AE3(50rf6)-EGFP、Ad55 AE1 AE3(5E4)-EGFP 產(chǎn)生的中和抗體比 Ad55 AE3-EGFP 略高。該結(jié)果說(shuō)明復(fù)制缺陷型Ad55載體可潛在的應(yīng)用于抗Ad55疫苗研發(fā)。
[0149] 實(shí)施例8 :復(fù)制缺陷型Ad55載體在研制抗埃博拉病毒疫苗中的應(yīng)用。
[0150] 按照實(shí)施例4、5所述方法，將埃博拉病毒囊膜蛋白GP(此處采用Zaier亞型的 兩種毒株，Guinea 2014株以及Maynial976株，分別命名為GP(ZG)以及GP(ZM))的編碼 基因密碼子優(yōu)化后克隆至穿梭載體PGK551，得到pGK551-GP(ZG)以及pGK551-GP(ZM)， 以BstZ17I+SgrAI線性化后與經(jīng)Pmel線性化的pAd55 A El A E3 (5E4)進(jìn)行重組，得到 pAd55-GP(ZG)、pAd55-GP(ZM)。進(jìn)一步用AsiSI線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，可拯救出攜帶埃 博拉包膜抗原基因的復(fù)制缺陷型Ad55載體。該載體可在靶細(xì)胞中高效表達(dá)埃博拉病毒包 膜抗原。如附圖8所示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明復(fù)制缺陷型Ad55載體可應(yīng)用于其他病原體疫苗的研 宄。
[0151] 以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專(zhuān)利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專(zhuān)利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種復(fù)制缺陷型人55型腺病毒載體，其特征在于，由如下方法制備得到：通過(guò)敲除 Ad55的EU E3基因，再將Ad55基因組中的E4基因開(kāi)放閱讀框6或開(kāi)放閱讀框2、3、4、6、 6/7改換為Ad5基因組的相應(yīng)閱讀框。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)制缺陷型人55型腺病毒載體，其特征在于，還在Ad55的 El基因區(qū)域整合外源基因表達(dá)框。
3. 權(quán)利要求1或2所述的復(fù)制缺陷型人55型腺病毒載體的制備方法，其特征在于，包 含如下步驟： 51. PCR擴(kuò)增Ad55El區(qū)同源重組臂并反向連接至卡那霉素抗性載體，線性化后與經(jīng)部 分酶切線性化的pAd55 A E3同源重組，得到基因組質(zhì)粒pAd55 A El A E3-Kana ; 52. PCR擴(kuò)增Ad55El區(qū)同源重組臂并同向連接至卡那霉素抗性載體，線性化后與線性 化的pAd55 A El A E3_Kana同源重組，得到基因組質(zhì)粒pAd55 A El A E3 ; 53. PCR 擴(kuò)增 Ad5E40rf2-6、Ad55E4 基因，以 Ad5E40rf2-6 取代 Ad55E4 基因中相應(yīng) 區(qū)域得到P55E4 (5E4)，線性化后與線性化的pAd55 A El A E3同源重組，得到基因組質(zhì)粒 pAd55 AEl AE3(5E4)； 54. PCR擴(kuò)增Ad5E40rf6,以其取代步驟S3.所述Ad55E4基因的相應(yīng)區(qū)域得 到p55E4 (50rf6)，線性化后與線性化的pAd55 A El A E3同源重組，得到基因組質(zhì)粒 pAd55 AEl AE3(50rf6)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟SI.的具體方法為：以Ad55基 因組為模板，PCR擴(kuò)增得到El基因同源重組臂L-delEl及R-delEl，酶切后連接至pVax載 體得到pVax-delEl (L+R)，線性化后，與經(jīng)部分酶切線性化的pAd55 A E3同源重組，經(jīng)氨芐 青霉素、卡那霉素雙抗性篩選得到敲除E1、E3基因并引入唯一酶切位點(diǎn)PmeI的基因組質(zhì)粒 pAd55 A El A E3_Kana。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟S2.的具體方法為：以Ad55基 因組為模板，PCR擴(kuò)增得到El基因同源重組臂L-delK(El)及R-delK(El)，酶切后連接至 pVax載體得到pVax-delK (El)，線性化后與線性化的pAd55 A El A E3_Kana同源重組，得到 去除E1、E3、卡那霉素基因并引入唯一酶切位點(diǎn)PmeI的基因組質(zhì)粒pAd55AEl AE3。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟S3.的具體方法為：分別以Ad5、 Ad55基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到Ad5E40rf2-6以及Ad55E4,將Ad55E4連接至T載體得 到P55E4,進(jìn)一步以p55E4為模板PCR去除Ad55E40rf2-6,然后與Ad5E40rf2-6連接得到 p55E4 (5E4)，線性化后與線性化的pAd55 A El A E3同源重組，得到pAd55 A El A E3 (5E4)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟S4.的具體方法為：以Ad5基 因組為模板，PCR擴(kuò)增得到Ad5E40rf6,將p55E4經(jīng)PCR去除Ad55E40rf6,兩者連接得到 p55E4 (50rf6)，線性化后與線性化 pAd55 A El A E3 同源重組，得到 pAd55 A El A E3 (50rf6)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，還包括如下步驟：
55. 以Ad55基因組為模板PCR得到El區(qū)同源重組臂SE1L、SE1R，酶切并 連接至PVax載體得到pSElLR ;以pGAl-EGFP為模板PCR得到外源基因表達(dá)框 CMV-EGFP-BGH，與pSElLR經(jīng)酶切、連接得到pGK551-EGFP，線性化后與線性化的權(quán) 利要求3、4所述pAd55 A El A E3 (5E4)、pAd55 A El A E3 (50rf6)分別同源重組得到 pAd55 A El A E3 (5E4) -EGFP、pAd55 A El A E3 (50rf6) -EGFP，進(jìn)一步線性化后轉(zhuǎn)染 293 細(xì)胞， 經(jīng)培養(yǎng)并離心純化得到復(fù)制缺陷型人55型腺病毒載體。
9. 權(quán)利要求1或2所述的復(fù)制缺陷型人55型腺病毒載體在制備疫苗、中和抗體或生物 學(xué)報(bào)告示蹤系統(tǒng)中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求1或2所述的復(fù)制缺陷型人55型腺病毒載體在制備抗人55型腺病毒的 疫苗或抗人55型腺病毒藥物中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一種復(fù)制缺陷型人55型腺病毒載體及其制備方法和應(yīng)用。所述的復(fù)制缺陷型人55型腺病毒載體由如下方法制備得到：通過(guò)敲除Ad55的E1、E3基因，再將Ad55基因組中的E4基因開(kāi)放閱讀框6或開(kāi)放閱讀框2、3、4、6、6/7改換為Ad5基因組的相應(yīng)閱讀框，此外還在Ad55的E1基因區(qū)域整合外源基因表達(dá)框。所述的載體能夠在293、PerC6等輔助細(xì)胞株中大量生產(chǎn)，并可以密度梯度離心濃縮純化；在正常人體細(xì)胞不具備復(fù)制能力因此具備減毒表型；此外，該載體還可在靶細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)外源基因。本發(fā)明所述載體可作為疫苗或基因治療載體，還可應(yīng)用于藥物及中和抗體的研發(fā)，以及報(bào)告示蹤系統(tǒng)。
【IPC分類(lèi)】A61K39-235, A61P31-14, C07K16-08, A61K39-12, A61P31-20, C12N15-64, C12N15-861, A61K48-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104846013
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510179459
【發(fā)明人】陳凌, 馮立強(qiáng)
【申請(qǐng)人】廣州福宸生物技術(shù)有限公司
【公開(kāi)日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年4月15日