一種異麥芽酮糖的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種異麥芽酮糖的制備方法，具體涉及一種直接利用微生物轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖的方法，屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]異麥芽酮糖(Isomaltulose)，又稱帕拉金糖，化學(xué)名稱為a -D-卩比喃葡糖基-1，6-D-果糖，是一種葡萄糖和果糖以α -1, 6-糖苷鍵結(jié)合形成的還原性二糖，天然存在于蜂蜜中，是蔗糖的同分異構(gòu)體，其口感和物理性質(zhì)與蔗糖非常相似，而甜度只有蔗糖的一半左右。由于人體本身無法消化異麥芽酮糖，只有被腸道微生物緩慢分解后才能進(jìn)入血液而被人體吸收，因此，食用后在血液中釋放單糖的速度比蔗糖慢而且不刺激胰島素分泌，因而有益于糖尿病的防治并可防止脂肪的過多積累。由于異麥芽酮糖特殊的生理功能，作為一種健康食品添加劑，在特定條件下可以作為蔗糖替代品應(yīng)用于食品工業(yè)。
[0003]異麥芽酮糖的批量生產(chǎn)起源于20世紀(jì)80年代中后期，是以蔗糖為原料，在蔗糖異構(gòu)酶(α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶，EC.5.4.99.11)的作用下，將蔗糖分子中葡萄糖與果糖相連的α -1, 2-糖苷鍵變位為α -1, 6_糖苷鍵，形成一種與蔗糖物理、化學(xué)性質(zhì)和生理功能完全不同的新糖，即異麥芽酮糖。目前，用于異麥芽酮糖生產(chǎn)的蔗糖異構(gòu)酶來源于各種微生物，如克雷伯氏菌(Klebsiella)、精I(xiàn)元桿菌屬(Psedumonas)、沙雷氏菌屬(Serratia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、假單胞菌屬(Psedumonas)等。
[0004]目前，世界各國(guó)如德國(guó)、美國(guó)、日本、中國(guó)等均采用固定化酶法生產(chǎn)異麥芽酮糖。中國(guó)專利文獻(xiàn)報(bào)道的異麥芽酮糖制備方法，摘錄如下:
[0005]中國(guó)專利CN1030530C，固定化α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶制備帕拉金糖，該發(fā)明公開了通過α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶菌種發(fā)酵、固定化、蔗糖轉(zhuǎn)化及濃縮結(jié)晶而制得帕拉金糖的工藝，其工藝過程中采用高嶺土吸附并收集發(fā)酵液中的菌體，然后采用海藻酸鈉與菌體混合，滴入到氯化鈣中進(jìn)行固定化，再經(jīng)戊二醛交聯(lián)處理制得用于轉(zhuǎn)化蔗糖液的固定化酶。該專利的固定化酶制作方法中使用戊二醛作為交聯(lián)劑，網(wǎng)絡(luò)百科中注明戊二醛對(duì)人體健康有危害:戊二醛對(duì)眼睛、皮膚和粘膜有強(qiáng)烈的刺激作用，吸入可引起喉、支氣管的炎癥、化學(xué)性肺炎、肺水腫等；因此，該專利固定化酶方法在食品加工領(lǐng)域中使用存在著食品安全隱患缺陷。
[0006]中國(guó)專利CN101200750A，一種大黃歐文氏菌及其在制備異麥芽酮糖中的應(yīng)用，該發(fā)明公開一種大黃歐文氏菌(Erwinia rhapontici)ΝΧ-5及利用該菌生產(chǎn)鹿糖異構(gòu)酶進(jìn)而制備異麥芽酮糖的方法。專利中的固定化方法為:配制I?3% (即I?3g/100mL)濃度的海藻酸鈉，加入10?25%的細(xì)胞(即每10mL海藻酸鈉溶液中加入10?25克的細(xì)胞)，并添加5?10%硅藻土(即每10mL海藻酸鈉溶液中加入5?10克的硅藻土)，再用濃度為I?4%的CaCl2溶液(g/100mL)將包埋材料海藻酸鈉固定成型，以此作為酶源進(jìn)行反應(yīng)。具體地說:將游離含蔗糖異構(gòu)酶的細(xì)胞或固定化后含蔗糖異構(gòu)酶的細(xì)胞填充至反應(yīng)罐中，加入45?600g/L的蔗糖溶液，或者將按照上述固定化方法制得的固定化細(xì)胞裝入填充式柱反應(yīng)器中，柱的體積不限。該反應(yīng)器可以0.5?5mL/min單向流加或循環(huán)連續(xù)流加450?600g/L的蔗糖溶液，在25?35°C的條件下進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間10?15h，通過調(diào)整流速，控制蔗糖的轉(zhuǎn)化率在90?100%之間，將收集流出液，濃縮結(jié)晶得到異麥芽酮糖。該專利的固定化菌體方法及蔗糖酶轉(zhuǎn)化方法生產(chǎn)效率低，僅適合制作少量樣品時(shí)使用。因此，該專利方法存在異麥芽酮糖產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)困難的缺陷。
[0007]中國(guó)專利CN101591689A，生物酶法轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖的方法，該發(fā)明所述固定化細(xì)胞在反應(yīng)罐內(nèi)和蔗糖溶液充分混合，固定化細(xì)胞懸浮在蔗糖溶液中，同時(shí)施加包括機(jī)械攪拌，壓縮空氣翻動(dòng)，循環(huán)泵等攪拌作用，使固定化細(xì)胞核蔗糖溶液充分接觸，加快轉(zhuǎn)化速度，直至轉(zhuǎn)化液中的異麥芽酮糖含量達(dá)到85%以上。該方法施加諸多的強(qiáng)烈地物理性攪拌行為，容易造成固定化細(xì)胞的機(jī)械性損傷、破碎，使固定化細(xì)胞的酶活性快速喪失而縮短固定化細(xì)胞的使用壽命，造成生產(chǎn)成本的大幅上升。因此，該專利方法存在異麥芽酮糖產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)成本高的缺陷。
[0008]中國(guó)專利CN102071235A，利用超聲波促進(jìn)酶制劑高效轉(zhuǎn)化異麥芽酮糖的方法，該發(fā)明的菌體包埋固定化及轉(zhuǎn)化過程為:將細(xì)胞濃漿1mL與1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2?4%的海藻酸鈉溶液以及100?100mg玻璃纖維粉(50?1000 μ m左右)混合，用注射器滴加到200mL0.2mol/L的CaCl2S液中，25?30°C下靜置固化2小時(shí)后，過濾洗滌；將顆粒體移至200mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1?0.2%的戊二醛溶液中，于33?37°C交聯(lián)2小時(shí)后，過濾洗滌后，得到球狀固定化酶；將固定化酶裝入轉(zhuǎn)化罐中并固定好，始終保持無污染狀態(tài)；轉(zhuǎn)化罐中設(shè)置有超聲波發(fā)射器，可發(fā)射一定頻率及強(qiáng)度可根據(jù)需要調(diào)整設(shè)定。該專利使用注射器制作固定化顆粒體的方法耗時(shí)，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)；同時(shí)，網(wǎng)絡(luò)百科中注明戊二醛對(duì)人體健康有危害:戊二醛對(duì)眼睛、皮膚和粘膜有強(qiáng)烈的刺激作用，吸入可引起喉、支氣管的炎癥、化學(xué)性肺炎、肺水腫等。因此，該專利固定化酶方法在食品加工領(lǐng)域中使用存在著無法產(chǎn)業(yè)化和食品安全隱患等缺陷。
[0009]中國(guó)專利CN102286454A，聚乙烯醇固定產(chǎn)蔗糖異構(gòu)酶菌體制備異麥芽酮糖方法，該發(fā)明公開了一種聚乙烯醇固定產(chǎn)蔗糖異構(gòu)酶菌體制備異麥芽酮糖方法，利用聚乙烯醇或/和硅藻土比例為2:0.8?1.21的酶載體4?50% (W/W)水溶液漿液，在溫度25?30°C加入產(chǎn)蔗糖異構(gòu)酶濕菌體5?30% (W/W)，攪拌均勻后置于-20°C以下硬化備用，使用時(shí)將固定化酶菌取出置于室溫下自然解凍，然后切成顆粒，加入蔗糖溶液異構(gòu)轉(zhuǎn)化，再用產(chǎn)蔗糖異構(gòu)酶分解轉(zhuǎn)化液中殘留的蔗糖，然后將轉(zhuǎn)化液采用脫色和離子交換進(jìn)行純化，經(jīng)濃縮結(jié)晶，離心分離后制得異麥芽酮糖產(chǎn)品。該專利使用聚乙烯醇制備固定化酶，在網(wǎng)絡(luò)百科詞條收集內(nèi)容中聚乙烯醇對(duì)人體健康有危害性，吸入、攝入或經(jīng)皮膚吸收后對(duì)身體有害，對(duì)眼睛和皮膚有刺激作用。因此，該專利固定化酶方法在食品加工領(lǐng)域中使用存在著食品安全隱患缺陷。
[0010]以上專利所公開的異麥芽酮糖制備所采用的菌體固定化方法及制備工藝存在以下不足:
[0011]1、固定化操作過程繁瑣、耗時(shí)、成本高，方法只適用于制備少量固定化酶，無法在工業(yè)化生產(chǎn)中推廣使用；
[0012]2、固定化載體使用了一些對(duì)人體有害的化工材料對(duì)食品安全構(gòu)成了危害，如戊二醛、聚乙烯醇等；
[0013]3、在蔗糖異構(gòu)化過程中，采用強(qiáng)烈地機(jī)械攪拌方式，容易造成固定化菌體破碎，不利于長(zhǎng)期保持固定化菌體的活性，從而增加了生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)便、設(shè)備投資少、生產(chǎn)成本低，且無食品安全隱患、能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的異麥芽酮糖的制備方法。
[0015]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:
[0016]一種異麥芽酮糖的制備方法，步驟如下:
[0017](I)以蔗糖溶液為原料，將蔗糖溶液和具有α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化菌體在轉(zhuǎn)化罐中混合，固定化菌體的加入量為蔗糖溶液的5?10% (W/W);通入無菌壓縮空氣，在溫度為25?32°C和pH5?7.5的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化，當(dāng)轉(zhuǎn)化液中蔗糖殘留量在2%以下時(shí)結(jié)束轉(zhuǎn)化；
[0018](2)將步驟(I)的轉(zhuǎn)化液經(jīng)脫色過濾和離子交換凈化工序，再經(jīng)濃縮、降溫結(jié)晶，得到異麥芽酮糖晶體。
[0019]步驟(I)中，所述蔗糖溶液為Brix40?60%的蔗糖溶液；
[0020]步驟(I)中，所述具有α -葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化菌體的制備方法為:
[0021]I)配制海藻酸鈉溶液??每100 kg水添加2?6 kg海藻酸鈉，對(duì)海藻酸鈉溶液進(jìn)行攪拌成均勾膠體，攪拌速度為50?300r/min，攪拌時(shí)間10?30分鐘；
[0022]2)氯化媽溶液制備:每100 kg水添加5?10 kg氯化媽、20?30 kg鹿糖，攪拌溶解；
[0023]3)將能夠產(chǎn)α -葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的菌的細(xì)胞濃漿與海藻酸鈉溶液按體積比1:(I?3)混勾，攪拌時(shí)速50?100r/min，攪拌時(shí)間5?15分鐘；
[0024]4)將混勻好的細(xì)胞濃漿與海藻酸鈉混合體移入制粒裝置中，通過制粒裝置獲得5?1mm的球狀至短棒狀的菌體，將菌體移入氯化鈣溶液中進(jìn)行固定化，固定化時(shí)間為2?4小時(shí)，得到固定化菌體；
[0025]進(jìn)一步的，所述具有α -葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化菌體的制備方法，還包括步驟5)將固定化好的菌體用濃度Brix25-35%的蔗糖溶液洗滌；除去附在固定化菌體表面上的氯離子、鈣離子等雜質(zhì)，減輕后續(xù)工藝中過濾、離子交換工序的壓力。
[0026]步驟3)中，所述能夠產(chǎn)α -葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞濃漿的制備方法為:
[0027]將能夠產(chǎn)α -葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過多級(jí)擴(kuò)大發(fā)酵獲得所需量的菌體，發(fā)酵溫度為25°C?30°C，pH6.0?7.5，發(fā)酵罐通氣量0.3?1.2m3/min，攪拌速度100?300r/min，培養(yǎng)時(shí)間12?48小時(shí)；
[0028]將發(fā)酵后的菌體進(jìn)行離心，收集細(xì)胞濃漿，即得；離心機(jī)轉(zhuǎn)鼓分離最小顆粒小于0.5微米，離心采用10000?15000r/min離心轉(zhuǎn)度，整個(gè)收集細(xì)胞濃漿過程溫度控制在15 ?30?。
[0029]所述能夠產(chǎn)α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的菌選自紅色精朊桿菌(Protaminobacterrubrum)、普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)、大黃歐文氏菌(Erwinia rhapontici)或克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)。
[0030]步驟4)中，所述制粒裝置包括筒體，筒體底部設(shè)有孔徑為2?5mm的小孔，開孔面積占筒體底部面積的90-95%，筒體內(nèi)設(shè)有容納物料的空腔；與筒體內(nèi)徑相同的活塞與壓桿相連，并通過壓桿在筒體內(nèi)做往復(fù)運(yùn)動(dòng)。
[0031]步驟(I)中，所述轉(zhuǎn)化罐為具有冷熱交換功能的不銹鋼罐，包括罐體，所述罐體外壁設(shè)有夾套層，罐體的底部設(shè)有攔截固定化菌體的網(wǎng)狀裝置，所述網(wǎng)狀裝置的下方設(shè)有無菌壓縮空氣進(jìn)氣管。
[0032]進(jìn)一步的，所述罐體內(nèi)設(shè)有換熱管，所述換熱管為列管、盤管或蛇管。
[0033]通過夾套和/或罐內(nèi)換熱管的冷水或熱水的冷熱交換調(diào)節(jié)不銹鋼罐內(nèi)轉(zhuǎn)化液的溫度。
[0034]所述網(wǎng)狀裝置是指滿孔洞的不銹鋼花板或不銹鋼篩網(wǎng)，孔洞可以是圓形、方形、三角形等形狀，孔洞直徑2_左右。
[0035]所述無菌壓縮空氣是指經(jīng)過除塵、除油水及除菌空氣過濾器處理后的壓縮空氣，在0.04Mpa條件下，氣體流量為0.5?1.5m3/m