在不存在全能核酸酶的情況下分離synagis*的方法
【專利說明】在不存在全能核酸酶的情況下分離synagis^的方法
[0001] 本申請包含一個經由EFS-Web向美國專利及商標局電子地提交為ASCII文本的序 列表，提交名稱為"RSVAB-300P1_序列表_ST25.txt"，具有10千字節(jié)的大小并且創(chuàng)建日期 為2013年11月4日。該電子地提交的序列表充當37CFR§ 1. 821 (c)要求的紙質復印件以 及§1. 821(e)要求的CRF兩者。該序列表中所含的信息通過引用結合在此。 發(fā)明領域
[0002] 本發(fā)明針對一種從組合物中分離抗體的方法。在一些實施例中，該方法包括從包 含Synagis"的組合物中分離Synagis% (帕利珠單抗），該方法包括：（i)對該組合物進 行一個離子交換色譜過程；（ii)對該組合物進行一個親和純化過程；以及（iii)對該組合 物進行一個過濾過程，其中一種終產物包括獲得自（i)、（ii)、和（iii)的Synagis氣其中 該終產物適合于向人類給予并且具有< 〇.5pg/mg的DNA濃度，并且其中該方法不包括向該 組合物中添加全能核酸酶（benzonase)。 發(fā)明背景
[0003] 抗體已經用于各種疾病與病癥的治療并且總體上衍生自使用真核或原核細胞系 的細胞培養(yǎng)物。然而，在藥物應用領域使用的抗體必須具有高純度，尤其是對于來自細胞培 養(yǎng)物的污染物而言，該細胞培養(yǎng)物包括細胞蛋白污染物、細胞DNA污染物、病毒以及其他可 傳染的藥劑。參見"WHO關于在生物制品生產中作為體外基質的動物細胞的應用要求：關于 生物活性物質 No.50 的要求"（"WHO Requirementsfortheuseofanimalcellsasin vitrosubstratesfortheproductionofbiologicals:RequirementsforBiological SubstancesNo.50. "）878號，附錄 1，1998。
[0004] 響應于關于污染物的關注點，世界衛(wèi)生組織（WHO)對多種污染物水平進行設限。 例如，WHO建議對于蛋白產品而言每個劑量的DNA限值小于10ng。同樣地，美國食品與藥品 管理局（FDA)設定DNA限值為小于或等于0. 5pg/mg蛋白。
[0005] 為了實現藥學上可接受的抗體要求的所需純度水平，已經報道了用于分離抗體的 多種方法。這些方法典型地涉及多個步驟以及除了其他細胞產物和污染物外，宿主細胞DNA 清除的報告，以達到與政府監(jiān)管的指導方針一致的純度水平。這些分離步驟取決于不同因 子而變化，包括進行分離的抗體的特征、要產生的量、表達系統(tǒng)、以及生長培養(yǎng)基。然而，一 般而言該分離過程涉及用于表達抗體的細胞的初步裂解、DNA降解步驟、一個或多個色譜步 驟、病毒去除步驟、以及一個過濾步驟，僅舉幾例。
[0006] 確保必要純度的過程可以是昂貴且耗時的。因此，經濟有效純化方法的發(fā)展對于 制藥和生物技術工業(yè)越來越重要。 發(fā)明概述
[0007] 本發(fā)明針對一種從組合物中分離Synagis61的方法。在一些實施例中，該方法包 括從包含Synagi的組合物中分離Synagis氣該方法包括：⑴對該組合物進行一個離 子交換色譜過程；（ii)對該組合物進行一個親和純化過程；并且（iii)對該組合物進行一 個過濾過程，其中一種終產物包括獲得自（i)、（ii)、和（iii)的Synagis'其中該終產物 適合于向人類給予并且具有<〇.5pg/mg的DNA濃度，并且其中該方法不包括向該組合物中 添加全能核酸酶。
[0008] 在一些實施例中，該方法不包括添加一種外源核酸酶到該組合物中。
[0009] 在一些實施例中，本發(fā)明的方法進一步包括進行一個病毒滅活過程。例如，在一些 實施例中，該病毒滅活過程包括在pH小于4. 0下孵育該組合物。
[0010]
[0011] 在一些實施例中，該親和純化過程包括一個蛋白A純化過程。在一些實施例中， 該離子交換色譜過程是一個陽離子交換色譜過程。在一些實施例中，該陽離子交換過程包 括使該抗體穿過選自下組的一種陽離子樹脂，該組由以下各項組成：卡普托S(CaptoS)、 S_ 交聯瓊脂糖FF(S-S印haroseFF)、以及波羅斯 50HS(Poros50HS)。
[0012] 在一些實施例中，該方法進一步包括一個第二離子交換過程。在一些實施例中，該 第二離子交換過程是一個陰離子交換色譜過程。
[0013] 在一些實施例中，該陰離子交換過程包括使該抗體穿過選自下組的一種陰離子 膜，該組由以下各項組成：超級Q(SuperQ)、那翠絲Q(NatrixQ)、科羅馬索布Q(Chromasorb Q)以及木斯塘Q(MustangQ)。
[0014] 在一些實施例中，該終產物具有>80% (mol/mol)的抗體得率。在一些實施例中， 該終產物的DNA濃度< 200ng/mg。
[0015] 在一些實施例中，該組合物選自下組，該組由以下各項組成：免疫動物血清、腹水 液、雜交瘤或骨髓瘤上清液、衍生自重組細胞系培養(yǎng)的條件培養(yǎng)基、以及產免疫球蛋白細胞 的細胞提取物。
[0016] 在一些實施例中，該組合物來自一個生物反應器。在一些實施例中，該組合物具有 大于100升的體積。在一些實施例中，該組合物具有大于1000升的體積。
[0017] 在一些實施例中，該親和純化過程發(fā)生在該離子交換過程后。在一些實施例中，該 過濾過程發(fā)生在該親和過程后。
[0018] 在一些實施例中，該方法包括從包含Synagis?的組合物中分離Synagis?,該 方法包括：（i)對該組合物進行一個陽離子交換色譜過程以形成一種包含該抗體的第一產 物；（ii)添加一種緩沖液到該第一產物中以形成一種緩沖產物；（iii)對該緩沖產物進行 一個親和純化過程以形成一種包含該抗體的第二產物；（iv)對該第二產物進行一個過濾 過程以形成一種包含該抗體的第三產物；（v)對該第三產物進行一個病毒滅活過程；并且 (vi)配制該第三產物以形成一種終產物，其中該終產物包含Synagis?，Synagis?適合 于向人類給予并且具有<〇.5pg/mg的DNA濃度；其中該方法不包括向該組合物中添加全能 核酸酶。
[0019] 在一些實施例中，該方法包括從包含Synagis?的組合物中分離Synagis'該方 法包括下列（i)-(v)中的至少三個：（i)對該組合物進行一個陽離子交換色譜過程；（ii) 對該組合物進行一個親和純化過程；（iii)對該組合物進行一個超濾過程；（iv)對該組合 物進行一個病毒滅活過程；以及（V)對該組合物進行一個陰離子交換色譜過程；其中獲得 自⑴-(v)中的至少三個的產物包含Synagis?，適合于向人類給予并且具有彡0. 5pg/mg 的DNA濃度；并且其中該方法不包括向該組合物中添加全能核酸酶。 附圖簡要說明
[0020] 圖1是實例1中描述的"全能核酸酶"以及"無全能核酸酶"（benzonase-free)過 程的示意圖。該過程包括陽離子交換色譜過程、三/氯化鎂緩沖液添加、蛋白A色譜過程、 納米過濾、低pH處理、以及陰離子交換色譜過程。
[0021] 圖2是實例2中描述的過程的示意圖。左欄表示其中在陽離子色譜過程后加或 "添加"（spike) 了DNA的分離過程。右欄表示其中在低pH處理過程之后添加了DNA的分 離過程。 發(fā)明詳細說明
[0022] 本發(fā)明在部分上是基于在不存在全能核酸酶的情況下，對分離抗體或其片段的方 法的開發(fā)。在一些實施例中，本發(fā)明的方法提供分離的抗體，該方法包括：（i)對該組合物 進行一個離子交換色譜過程；（ii)對該組合物進行一個親和純化過程；以及（iii)對該組 合物進行一個過濾過程，其中一種終產物獲得自（i)、（ii)、和（iii)，其中該終產物適合于 向人類給予并且具有< 0. 5pg/mg的DNA濃度，并且其中該方法不包括向該組合物中添加全 能核酸酶。在一些實施例中，該抗體具有大于8.0的等電點。在一些實施例中，該抗體具有 大于9. 0的等電點。
[0023] 在一些實施例中，本發(fā)明的方法使得制造商能夠以更有效的方式生產適用于向 人類給予的抗體藥物產品，該方式為通過降低成本、減少方法步驟、降低錯誤機會、降低不 安全或不適當添加劑引入的機會等等，通過省去全能核酸酶或在一些實施例中任何外源 核酸酶的添加。在本發(fā)明中，抗體可以在不添加全能核酸酶的情況下來分離，以前該全 能核酸酶已在適合于向人類給予的抗體的分離過程中被添加。全能核