擬南芥抗橡膠樹白粉菌基因roh1的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及擬南芥抗橡膠樹白粉菌基因 ROHl的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 橡膠樹白粉病是由橡膠樹白粉菌（Oidium heveae)引發(fā)的一種真菌病害。該病發(fā) 生時間，以每年春節(jié)前后橡膠樹開始萌芽或抽出古銅色葉開始，如遇氣溫偏涼、空氣濕度大 的天氣，若未及時采取噴藥防治，白粉病會在3~5天后造成大面積膠樹新抽葉感病。嫩葉 感病初期，葉正面或反背面出現(xiàn)銀白色蜘蛛網(wǎng)狀菌絲，而后逐漸擴(kuò)大，在葉表面長出白色粉 狀物，形成大小不一的不規(guī)則粉斑（圖1)。發(fā)病嚴(yán)重時，葉片正反兩面布滿白色粉狀物，嚴(yán) 重的葉片主脈或側(cè)脈生長成畸形，整個葉片不能正常伸長，皺縮，遇到高溫時，葉變黃，最終 脫落（圖2)。不脫落的病葉會留下黃褐色壞死斑。如當(dāng)年發(fā)生白粉病害較重又得不到有效 控制，將導(dǎo)致橡膠樹大量新抽葉片落葉，使橡膠樹不能正常開割，對當(dāng)年膠乳產(chǎn)量有顯著影 響。
[0003] 在世界范圍內(nèi)，橡膠樹白粉病得不到有效的控制將對當(dāng)年膠乳產(chǎn)量有顯著影響， 造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)前，我國對橡膠樹白粉病的防治主要以化學(xué)防治為主，對環(huán)境造成 了嚴(yán)重污染。因而，從分子水平進(jìn)行抗白粉病基因的篩選及抗病育種是一個非常有希望的 解決橡膠樹白粉病的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是提供ROHl蛋白或其編碼基因或含有其編碼基因的重組載體 的用途。
[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供ROHl蛋白或其編碼基因或含有其編碼基因的重組載體 在調(diào)控植物抗病性中的應(yīng)用；
[0006] 所述ROHl蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。
[0007] 上述應(yīng)用中，所述ROHl蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列1。
[0008] 上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物抗病性為提高植物抗病性。
[0009] 上述應(yīng)用中，所述病的病原菌為橡膠樹白粉菌；所述植物為單子葉植物或雙子葉 植物；所述雙子葉植物具體為十字花科植物。所述十字花科植物尤其具體為擬南芥突變體 N680465或擬南芥突變體N680496。
[0010] ROHl蛋白或其編碼基因或含有其編碼基因的重組載體在培育抗病轉(zhuǎn)基因植物中 的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0011] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育抗病轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0012] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：將ROHl蛋白編碼基因?qū)肽康闹参?，得到轉(zhuǎn) 基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的抗病性高于所述目的植物；
[0013] 所述ROHl蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。
[0014] 上述方法中，所述ROHl蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列1。
[0015] 上述方法中，所述ROHl蛋白編碼基因通過重組載體導(dǎo)入目的植物；
[0016] 所述重組載體為將所述ROHl蛋白編碼基因插入表達(dá)載體，得到的表達(dá)ROHl蛋白 的重組載體。
[0017] 上述病的病原菌為橡膠樹白粉菌。
[0018] 上述方法或應(yīng)用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體 為十字花科植物。所述十字花科植物尤其具體為擬南芥突變體N680465或擬南芥突變體 N680496。
[0019] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明從橡膠樹表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，橡膠樹含有大量 TIR-NB-LRR類抗性蛋白，由于擬南芥AtEDSl在橡膠樹上的同源基因 HbEDSl可以功能互補(bǔ) 擬南芥AtEDSl突變引起的抗性減弱，推測橡膠樹存在與擬南芥類似的抗性機(jī)制。本發(fā)明將 ROHl基因互補(bǔ)ROHl突變的擬南芥突變體，得到轉(zhuǎn)基因植物恢復(fù)野生型擬南芥的抗橡膠樹 白粉病表型。因此證明，ROHl為抗橡膠樹白粉病基因，可用于培育抗病育種奠定了非常好 的基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0020] 圖1為橡膠樹白粉菌在橡膠樹上的致病圖片。
[0021] 圖2為橡膠樹白粉菌在橡膠樹葉片上的后期致病圖片。
[0022] 圖3為橡膠樹白粉菌在擬南芥野生型和相應(yīng)突變體，以及橡膠樹GT-I品系上的致 病圖片。
[0023] 圖4為橡膠樹白粉菌在擬南芥野生型和相應(yīng)突變體上激活的細(xì)胞死亡結(jié)果Bar = IOOuM0
[0024] 圖5為橡膠樹白粉菌在擬南芥野生型和相應(yīng)突變體上激活的活性氧產(chǎn)生結(jié)果Bar =IOOuM0
[0025] 圖6為橡膠樹白粉菌在擬南芥野生型和相應(yīng)突變體上激活的胼胝體沉積結(jié)果 與Col-O相比進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析P〈0. 01)
[0026] 圖7為橡膠樹白粉菌在擬南芥野生型和相應(yīng)突變體上激活的致病相關(guān)基因 PRl表 達(dá)結(jié)果（**與Col-ο相比進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析P〈0. 01)。
[0027] 圖8為考馬斯亮藍(lán)染色橡膠樹白粉菌在擬南芥上及其相應(yīng)突變體上的侵染結(jié)果 Bar = lOOuM。
[0028] 圖9為橡膠樹白粉菌在擬南芥野生型和相應(yīng)突變體，以及橡膠樹GT-I品系上產(chǎn)生 的分生孢子計數(shù)結(jié)果（**與Col-O相比進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析P〈0. 01)。
[0029] 圖10為橡膠樹白粉菌在擬南芥野生型和突變體rohl以及ROHl轉(zhuǎn)基因植株上的 致病圖片，分生孢子產(chǎn)生結(jié)果（**與Col-ο相比進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析P〈0. 01)。
[0030] 圖11為ROHl轉(zhuǎn)基因植物蛋白檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0031 ] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0032] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0033] 實施例1、與橡膠白粉病菌抗性相關(guān)基因 ROHl的篩選
[0034] I、與橡膠白粉病菌抗性相關(guān)通路確定
[0035] 橡膠白粉病菌HO-73,記載在如下文獻(xiàn)中：橡膠樹白粉菌收集及DNA和RNA提取方 法比較，廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013年第11期，134-139.萬三連，梁鵬，宋風(fēng)雅，張宇，劉文波，繆衛(wèi) 國，鄭服叢。
[0036] 橡膠樹白粉菌能否侵染模式植物擬南芥，在擬南芥上介導(dǎo)的是怎樣的一種相互作 用，以及擬南芥是否可以作為工具來研宄橡膠樹白粉菌的致病機(jī)理，目前仍然是未知的。
[0037] 通過將橡膠白粉病菌HO-73接種橡膠樹GT-I品系、擬南芥野生型Col-O以及擬南 芥突變體edsl，pad4, rarl，ndrl，nprl，NahG和sid2的葉片。接種10天后，發(fā)現(xiàn)在橡膠樹 GT-I葉片上出現(xiàn)了明顯的白粉病病斑，有趣的是，在擬南芥Col-O葉片上出現(xiàn)黃化，壞死的 表型，這種表型依賴于EDSl，PAD4, RARl和SA通路的相關(guān)基因 NPRl，NahG以及SID2,但不 依賴于NDRl (圖3)。進(jìn)一步試驗發(fā)現(xiàn)，Oidium heveaeHNl 106在Col-O葉片上激發(fā)大量的 細(xì)胞死亡（圖4)，活性氧產(chǎn)生（圖5)，胼胝體沉積（圖6)和致病相關(guān)基因的劇烈表達(dá)（圖 7)，并且這些表型同樣依賴于EDSl，PAD4, RARl和SA通路，但不依賴于NDRl。
[0038] 通過顯微鏡觀察，接種Oidium heveae HN1106 10天后，在Col-O葉片上僅僅可 以看到散在的真菌孢子以及微量的菌絲生長，不能看到分生孢子的產(chǎn)生；在突變體edsl和 pad4上，可以觀察到大量的菌絲生長以及大量分生孢子的產(chǎn)生；在rarl突變體上可以看到 大量菌絲的生長，但不能看到分生孢子的產(chǎn)生；SA通路的突變體和ndrl突變體表現(xiàn)出與野 生型相同的表型（圖8,9)。
[0039] 上述結(jié)果表明，橡膠樹白粉菌可以被擬南芥識別激活抗病反應(yīng)，并且抗病基因的 功能依賴于EDSl，PAD4,但不依賴于NDRl。
[0040] 2、與橡膠白粉病菌抗性相關(guān)基因 ROHl的篩選
[0041] 提取86個依賴于EDS1，PAD4、但不依賴于NDRl信號通路的擬南芥突變體的基因 組DNA，PCR鑒定后，并且初步獲得了 58個基因的突變體純合系。將橡膠樹白粉菌分別接 種于58個突變體純合系上，篩選出1個對橡膠樹白粉菌感病擬南芥突變體N680465。進(jìn)一 步訂購了該突變基因的另一個位點(diǎn)插入突變體N680496。出售公司：NASC，The European Arabido