量就越多，檢測(cè)器所接收到的 熒光就越少。
[0028] 本發(fā)明在符合基本的使用要求下，可以采用上述通常的供體和受體分別作為FRET 熒光供體蛋白10、FRET熒光受體蛋白20。而在FRET融合熒光探針性能更優(yōu)，本申請(qǐng)中分 別采用設(shè)計(jì)的具有序列表SEQ. ID. No. 2氨基酸序列的CFP蛋白作為FRET熒光供體蛋白10 ; 進(jìn)一步配合采用具有序列表SEQ. ID. No. 3氨基酸序列的cpVenus蛋白作為FRET熒光受體 蛋白20。其中，從序列表可以看出CFP蛋白，它包括286個(gè)氣基酸序列；而cpVenus蛋白是 一種環(huán)化的黃色熒光蛋白，它包括245氨基酸序列。CFP的發(fā)射光譜與cpVenus蛋白的吸收 光譜相重疊，供體CFP發(fā)出的焚光可被cpVenus蛋白吸收，并激發(fā)cpVenus蛋白發(fā)出黃色焚 光，并且這兩個(gè)蛋白設(shè)計(jì)上相互作用，能產(chǎn)生CFP熒光強(qiáng)度的損失，進(jìn)而產(chǎn)生FRET，用于檢 測(cè)。
[0029] 當(dāng)然，需要指出的是，根據(jù)技術(shù)人員在多肽間進(jìn)行銜接手段，上述FRET熒光供體 蛋白10、FRET熒光受體蛋白30分別和多肽底物30之間的連接，由于本身都是端側(cè)的氨基 酸殘基的連接，那么可以順次依照所需相連的兩相鄰的氨基酸的N端和C端的結(jié)合順序進(jìn) 行銜接。
[0030] 而進(jìn)一步，在上述實(shí)施方式中，出于設(shè)計(jì)的上述多肽的氨基酸序列的作用和結(jié)合， 在CFP蛋白與多肽底物之間、以及cpVenus蛋白與多肽底物之間的銜接通過(guò)一個(gè)連接元件 進(jìn)行。其中，該連接元件采用是長(zhǎng)度為3~8個(gè)氨基酸殘基的多肽，通過(guò)這一過(guò)渡的連接元 件，能進(jìn)一步利于保證上述三段功能蛋白銜接的操作，并且還能避免直接連接導(dǎo)致可能改 變或者影響各自原始功能或者性能，影響熒光信號(hào)的檢測(cè)?；谏鲜?，本發(fā)明中優(yōu)選采用設(shè) 計(jì)的連接元件具有序列表SEQ. ID. No. 4氨基酸序列，其為GSGGG的五個(gè)氨基酸組成的寡肽， 其N(xiāo)端和C端均具有完整的胺基和羧基，可以分別用于與熒光蛋白或者是MMP-13特異性識(shí) 別降解多肽底物的C端/N端結(jié)合，實(shí)現(xiàn)連接。
[0031] 采用本發(fā)明的上述FRET融合熒光探針，在構(gòu)造的過(guò)程中，應(yīng)用基因工程技術(shù)將 MMP-13酶作用底物序列GPLGMRGL的兩端（N端和C端）分別與青色熒光蛋白（CFP)和 黃色焚光蛋白（cpVenus)相連，構(gòu)建了一個(gè)基于GFP的焚光能量共振轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)探針。構(gòu)件的完整氨基酸序列的檢測(cè)MMP-13活性的 FRET融合熒光探針其完整的序列具有序列表SEQ. ID. No. 5氨基酸序列。構(gòu)建完成之后，采 用熒光光譜分析，分析的結(jié)果顯示，該熒光融合蛋白中CFP和cpVenus之間存在著較強(qiáng)的 FRET，序列設(shè)計(jì)和結(jié)合結(jié)果較為準(zhǔn)確。
[0032] 進(jìn)一步，在上述基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步提出一種采用上述FRET融合熒光探針進(jìn)行 MMP-13蛋白酶活性的測(cè)定方法，其可以參考如下步驟進(jìn)行：
[0033] S10,獲取待測(cè)樣品；
[0034] S20,將待測(cè)樣品與FRET融合熒光探針進(jìn)行孵育，并檢測(cè)熒光信號(hào)。
[0035] 上述檢測(cè)的步驟和方法中，基于FRET融合熒光探針自身存在的FRET加強(qiáng)熒光在 探針的底物被MMP-13降解后熒光降低，因此根據(jù)檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度的變化情況，即可能夠 確定待測(cè)樣品中MMP-13蛋白酶活性。
[0036] 同時(shí)，在上述情形下，以標(biāo)準(zhǔn)的MMP-13蛋白酶作為待測(cè)樣品進(jìn)行探針的驗(yàn)證，步 驟按照上述進(jìn)行，用FRET融合熒光探針與標(biāo)準(zhǔn)濃度MMP-13蛋白酶進(jìn)行孵育后，熒光信號(hào)逐 漸降低，證明本發(fā)明設(shè)計(jì)的探針能被MMP-13酶切；并且將孵育后的產(chǎn)物，用SDS-PAGE分析， 其結(jié)果如圖3所示。圖3中條帶1為探針與MMP-13孵育后的探針產(chǎn)物電泳條帶、條帶2為 空白不加 MMP-13孵育的探針對(duì)照電泳條帶、條帶3為分子marker。從條帶1和2的對(duì)比， 顯示探針與MMP-13孵育后，熒光融合蛋白由60kD大小逐漸變成30kD大小的蛋白，即表明 探針被MMP-13切成CFP和cpVenus分子。并且在孵育中，檢測(cè)產(chǎn)生的熒光信號(hào)變化圖，參 見(jiàn)圖4所示（橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)為熒光密度/強(qiáng)度）。
[0037] 并且根據(jù)不同標(biāo)準(zhǔn)濃度的MMP-13蛋白酶進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果如圖5所示，可以得到 相關(guān)的函數(shù)或者系數(shù)，然后便可用于輔助未知待測(cè)樣的分析和計(jì)算。
[0038] 在實(shí)施的過(guò)程中，待測(cè)的樣品如果是蛋白成分形式，那么可以直接按照上述方法 步驟進(jìn)行孵育后，測(cè)量熒光信號(hào)。如果是提取的待測(cè)的細(xì)胞組織樣本等等非蛋白成分形 式，那么可以采用實(shí)驗(yàn)室常用的活性蛋白提取的試劑盒或者方法，將組織破碎后提取全蛋 白，然后以提取的全蛋白作為待測(cè)樣品，與FRET融合熒光探針?lè)跤?，檢測(cè)熒光信號(hào)變化情 況。當(dāng)然，這里可以知曉的是，熒光信號(hào)的變化情況與MMP-13活性濃度相關(guān)，檢測(cè)中隨著 MMP-13酶的含量增加，F(xiàn)RET熒光信號(hào)強(qiáng)度隨之減弱。
[0039] 在本發(fā)明的上述發(fā)明FRET探針檢測(cè)的立意下，本發(fā)明進(jìn)一步提出一種用于編碼 FRET融合熒光探針的DNA，該DNA具有SEQ. ID. No. 6的核苷酸堿基序列。
[0040] 根據(jù)DNA與蛋白質(zhì)編碼翻譯的對(duì)應(yīng)關(guān)系，本發(fā)明的上述DNA的序列表與目的FRET 融合熒光探針的編碼對(duì)應(yīng)關(guān)系如下表：
[0041]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)MMP-13活性的FRET融合熒光探針，其特征在于，包括FRET熒光供體蛋白、 FRET熒光受體蛋白； 所述FRET熒光供體蛋白和FRET熒光受體蛋白之間通過(guò)MMP-13特異性識(shí)別降解多肽 底物連接。
2. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)MMP-13活性的FRET融合熒光探針，其特征在于，所述 MMP-13特異性識(shí)別降解多肽底物具有序列表SEQ. ID. No. 1的氨基酸序列。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)MMP-13活性的FRET融合熒光探針，其特征在于，所述 FRET熒光供體蛋白具有序列表SEQ. ID. No. 2氨基酸序列； 及/或，所述FRET熒光受體蛋白具有序列表SEQ. ID. No. 3氨基酸序列.
4. 如權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)MMP-13活性的FRET融合熒光探針，其特征在于，所述 FRET熒光供體蛋白與MMP-13特異性識(shí)別降解多肽底物兩者之間通過(guò)連接元件連接； 及/或述FRET熒光受體蛋白與MMP-13特異性識(shí)別降解多肽底物兩者之間通過(guò)連接元 件連接； 其中，所述連接元件為長(zhǎng)度3~8個(gè)氨基酸殘基的多肽。
5. 如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)MMP-13活性的FRET融合熒光探針，其特征在于，所述連接 元件為具有序列表SEQ. ID. No. 4氨基酸序列的寡肽。
6. -種MMP-13活性的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟： 獲取待測(cè)蛋白樣品； 將所述待測(cè)蛋白樣品與權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的FRET融合熒光探針進(jìn)行孵育，并 檢測(cè)焚光信號(hào)。
7. -種DNA，用于編碼權(quán)利要求5所述的FRET融合熒光探針，其特征子在于，所述DNA 具有SEQ. ID. No. 6的核苷酸堿基序列。
8. -種表達(dá)權(quán)利要求7所述的DNA的表達(dá)載體。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測(cè)MMP-13活性的FRET融合熒光探針，包括通過(guò)MMP-13特異性識(shí)別降解多肽底物連接的FRET熒光供體蛋白和FRET熒光受體蛋白。本發(fā)明的探針，其利用FRET熒光供體蛋白、FRET熒光受體蛋白分別作為能量共振轉(zhuǎn)移的熒光供體和受體，并通過(guò)一段能被待測(cè)的MMP-13特異性識(shí)別和降解的多肽底物連接，使其能產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。在檢測(cè)的過(guò)程中，探針的上述多肽底物被MMP-13特異性識(shí)別和降解，那么FRET熒光供體蛋白和FRET熒光受體蛋白之間由于失去連接，產(chǎn)生相互分離，因此導(dǎo)致FRET現(xiàn)象消失，此時(shí)根據(jù)熒光信號(hào)的變化情況，便可以得到待測(cè)的樣品中MMP-13的含量，從而實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)捷快速和能更加準(zhǔn)確地檢測(cè)MMP-13活性的目的。
【IPC分類(lèi)】C12N15-62, C07K19-00, C12Q1-37
【公開(kāi)號(hào)】CN104861073
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510072905
【發(fā)明人】王大平, 梁宇杰, 段莉
【申請(qǐng)人】深圳市第二人民醫(yī)院
【公開(kāi)日】2015年8月26日
【申請(qǐng)日】2015年2月10日