表達(dá)bFGF和PDGF-BB的重組載體修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及表達(dá)bFGF和roGF-ΒΒ的重組載體修飾的 間充質(zhì)干細(xì)胞及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 缺血性疾病以其高發(fā)病率和致死致殘率，嚴(yán)重威脅人類健康。流行病學(xué)調(diào)查顯示 嚴(yán)重肢端缺血有很高的發(fā)病率。血管主干閉塞后，首先由側(cè)枝血管代償供應(yīng)相應(yīng)組織。當(dāng) 側(cè)枝循環(huán)不足以供應(yīng)灌注組織時(shí)，便會(huì)發(fā)生缺血，從而引起臨床癥狀和體征。目前血管閉塞 性病變的主要治療手段是血管成形術(shù)、血管內(nèi)支架置入術(shù)和血管旁路移植術(shù)和，以及，然 而這些手段往往不持久，也易造再狹窄和堵塞 [2]。嚴(yán)重遠(yuǎn)端肢體缺血，尤其是糖尿病患者， 常沒有手術(shù)治療的條件。冠狀動(dòng)脈疾病可致心肌梗死，危及生命，雖然目前經(jīng)皮經(jīng)導(dǎo)管血管 成型術(shù)（PTCA)或冠脈旁路移植（CABG)能一定程度上恢復(fù)緩解臨床癥狀。然而這些診療手 段易導(dǎo)致血管再狹窄，移植支架也易再堵塞。因此，新的治療方法仍需探索。
[0003] 血管生成方式包括血管生成、血管新生和動(dòng)脈生成。血管生成是個(gè)極其復(fù)雜的 生物學(xué)過程，由促血管生成因子和血管生成抑制因子共同起作用。目前已發(fā)現(xiàn)的促血管 生成因子有VEGF、bFGF、TOGF-BB(H)GF-B基因表達(dá)的蛋白形成的同源二聚體結(jié)構(gòu)，稱為 TOGF-BB)和Ang-I等。血管生成抑制因子有angiostatin、HMPs和TSP-I等。二者之間的 平衡調(diào)節(jié)新生血管的形成。治療性血管生成是指通過增加局部血管生成因子來克服本身血 管生成反應(yīng)的缺陷，促進(jìn)血管生成，包括給予重組的血管生成因子，表達(dá)血管生成因子的基 因和細(xì)胞治療等。目前多種促血管生長因子應(yīng)用于缺血性疾病的基因治療，如aFGF、bFGF、 VEGF等。然而，單基因治療效果不太理想，這可能與血管生成過程復(fù)雜而單基因治療過于簡 單相關(guān)。多基因聯(lián)合治療的方法，與相應(yīng)的單基因治療相比，明顯促進(jìn)血管生成，如VEGF聯(lián) 合 FGF，G-CSF 聯(lián)合 HGF，VEGF 聯(lián)合 MCP-I。
[0004] 干細(xì)胞治療已成為治療許多疾病重要手段。間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs)存在于機(jī)體多種組織，具有向多種細(xì)胞分化能力的多能干細(xì)胞。體外經(jīng)誘導(dǎo)可 分化為軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、造血基質(zhì)等。由于MSCs不僅可以向多種組織細(xì)胞分 化，體外容易分離培養(yǎng)和擴(kuò)增，還具有低免疫原性的特點(diǎn)，MSCs已經(jīng)被廣泛用于多種疾病的 細(xì)胞治療，如心肌梗死、腦卒中、肢端缺血、軟骨修復(fù)、脊柱融合、自身免疫性疾病等。
[0005] 雖然目前間充質(zhì)干細(xì)胞治療疾病有著良好的前景，但間充質(zhì)干細(xì)胞的來源嚴(yán)重 限制著其治療應(yīng)用。目前間充質(zhì)干細(xì)胞多來源于骨髓，方法有創(chuàng)傷、細(xì)胞數(shù)量少、動(dòng)員劑 G-CSF的應(yīng)用增加血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)；另外，糖尿病、高脂血癥、高齡等因素均削弱骨髓間充 質(zhì)干細(xì)胞的功能，嚴(yán)重限制了骨髓來源的MSCs的臨床應(yīng)用。雖然有學(xué)者探索外周血和脂 肪組織MSCs的治療應(yīng)用，但這些MSCs亦存在數(shù)量少的特點(diǎn)。近年發(fā)現(xiàn)，臍帶是獲得MSCs 的良好來源。臍帶容易獲得，含間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量多，亦具有低免疫原性的特點(diǎn)，因而存 在廣泛應(yīng)用前景。臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞（Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells，UC-MSCs)已被用于多種缺血性疾病的治療并取得一定的效果。
[0006] 細(xì)胞治療聯(lián)合基因治療是另一種增強(qiáng)治療效果的策略?；蛐揎椀拈g充質(zhì)干細(xì) 胞、骨髓單個(gè)核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞等均顯示了良好的治療效果。目 前尚無 bFGF和TOGF-B雙基因修飾的人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺血性疾病的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為有效治療肢端缺血性疾病提供新選擇。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案是一種表達(dá)bFGF和I3DGF-B的重組載體修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞， 該重組載體含有bFGF蛋白的編碼基因與TOGF-BB蛋白的編碼基因，能在真核細(xì)胞中同時(shí)表 達(dá)bFGF蛋白與TOGF-BB蛋白。
[0009] 具體的，所述的bFGF蛋白為人bFGF蛋白，其編碼基因具有如Seq ID No. 1所示的 核苷酸序列。
[0010] 具體的，所述的roGF-ΒΒ蛋白為人roGF-BB蛋白，其編碼基因具有如Seq ID No. 2 所示的核苷酸序列。
[0011] 優(yōu)選的，bFGF蛋白由SV40啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)。
[0012] 具體的，表達(dá)bFGF蛋白的表達(dá)框架的構(gòu)成是：從5'到3'方向依次為SV40啟動(dòng) 子、人IL-2信號(hào)肽的編碼序列、編碼bFGF蛋白的基因、SV40加尾信號(hào)。
[0013] 具體的，表達(dá)bFGF蛋白的表達(dá)框架具有如Seq ID No. 3所示的核苷酸序列。
[0014] 優(yōu)選的，PDGF-BB蛋白由CMV5啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)。
[0015] 具體的，表達(dá)I3DGF-BB蛋白的表達(dá)框架的組成是：從5'到3'方向依次為CMV5啟 動(dòng)子、人I 3DGF-B蛋白信號(hào)肽的編碼序列、編碼PDGF-BB蛋白的基因 、β -珠蛋白加尾信號(hào)。
[0016] 具體的，表達(dá)I3DGF-BB蛋白的表達(dá)框的具有如Seq ID No. 4所示的核苷酸序列。
[0017] 具體的，所述重組載體具有Seq ID No. 5所示的核苷酸序列。
[0018] 優(yōu)選的，所述重組載體為腺病毒載體。
[0019] 最優(yōu)的，所述的腺病毒為復(fù)制缺陷型腺病毒。
[0020] 優(yōu)選的，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞來源于臍帶。
[0021] 本發(fā)明還提供了雙基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法，包括如下步驟：構(gòu)建同時(shí) 表達(dá)bFGF蛋白與TOGF-BB蛋白的腺病毒載體；從臍帶分離間充質(zhì)干細(xì)胞，選擇第5-8代處 于對(duì)數(shù)生長期的間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞生長至70-80%匯合時(shí)，用構(gòu)建好的腺病毒載體進(jìn)行感 染；37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)48h，即獲得雙基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0022] 本發(fā)明還提供了治療缺血性疾病的藥物，其主要活性成分為所述的表達(dá)bFGF和 TOGF-BB的重組載體修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0023] 本發(fā)明還提供了所述表達(dá)bFGF和TOGF-BB的重組載體修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞在制 備治療缺血性疾病藥物中的用途。
[0024] 具體的，所述的缺血性疾病為冠心病引發(fā)的心肌缺血、肢端缺血或腦缺血。
[0025] 本發(fā)明選擇從臍帶中分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，有利于投入應(yīng)用時(shí)獲得大量間充質(zhì) 干細(xì)胞，克服細(xì)胞來源少的問題。
[0026] 本發(fā)明重組載體是重組了人bFGF和人TOGF-B編碼基因的雙基因載體。研宄發(fā)現(xiàn) 二者聯(lián)合應(yīng)用可以更明顯地促進(jìn)小動(dòng)脈的生成及成熟，有利于克服單個(gè)基因引起的不足。 重組載體中人bFGF和人TOGF-B編碼基因可以處于同一個(gè)啟動(dòng)子的調(diào)控下進(jìn)行體內(nèi)的表 達(dá)，也可以處于兩個(gè)單獨(dú)的啟動(dòng)子的調(diào)控之下。最好能構(gòu)建兩個(gè)單獨(dú)的表達(dá)框架，以對(duì)兩個(gè) 基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行一定的控制。兩個(gè)表達(dá)框架既可以同向，也可以反向。本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以根據(jù)本發(fā)明中的記載，參考本領(lǐng)域的現(xiàn)有的基因操作指南和實(shí)驗(yàn)手冊(cè)制備得到重 組。
[0027] 本發(fā)明重組載體的載體骨架可以是質(zhì)粒載體或病毒載體，優(yōu)選使用在真核動(dòng)物中 轉(zhuǎn)基因效率更高的腺病毒載體。另外，在重組雙基因的腺病毒載體構(gòu)建中，為了避免重組腺 病毒在真核細(xì)胞中的擴(kuò)增過程中發(fā)生同源重組，可以選擇兩個(gè)不同的啟動(dòng)子和不同的加尾 信號(hào)構(gòu)建兩個(gè)單獨(dú)的表達(dá)框架。兩個(gè)啟動(dòng)子和加尾信號(hào)序列的同源性應(yīng)盡可能降低一些， 以有效地避免生產(chǎn)過程中的同源重組，有利于重組雙基因腺病毒大量生產(chǎn)時(shí)的質(zhì)量控制。
[0028] 在本發(fā)明的研宄中，在行股動(dòng)脈結(jié)扎后1周，給予生理鹽水（NS)、臍帶來源間充質(zhì) 干細(xì)胞（UC-MSCs)、空載腺病毒修飾的臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞（Ad-Null-UC-MSCs)和bFGF 和TOGF-B雙基因修飾的臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞（Ad-FP-UC-MSCs)治療。結(jié)果表明bFGF和 TOGF-B雙基因修飾的臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞能改善肢端缺血，其主要是通過促進(jìn)側(cè)枝動(dòng)