一種新型溫度響應(yīng)性無(wú)機(jī)焦磷酸酶偶聯(lián)物的合成及其在增強(qiáng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于聚合物蛋白質(zhì)偶聯(lián)技術(shù)及其在生物學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種新型溫度響應(yīng)性的無(wú)機(jī)焦磷酸酶的合成，通過(guò)修飾有硫代吡啶基團(tuán)的溫度響應(yīng)性聚合物聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)與定點(diǎn)突變含有巰基的無(wú)機(jī)焦磷酸酶(PPase)進(jìn)行定位共價(jià)結(jié)合，獲得偶聯(lián)物并促進(jìn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的效率增強(qiáng)。
【背景技術(shù)】
[0002]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一項(xiàng)在體外模擬DNA復(fù)制過(guò)程的生物學(xué)技術(shù)，它在現(xiàn)代分子生物學(xué)研宄，生物基因工程以及臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)等領(lǐng)域發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。但是研宄發(fā)現(xiàn)，在該反應(yīng)的進(jìn)行過(guò)程當(dāng)中，會(huì)產(chǎn)生大量副產(chǎn)物焦磷酸根離子(P2074_，PPi)，PPi的存在會(huì)阻礙反應(yīng)向正方向進(jìn)行，導(dǎo)致PCR效率的下降，因此清除PPi是提高PCR效率的關(guān)鍵。
[0003]通常，包括焦磷酸在內(nèi)的多磷酸結(jié)構(gòu)的物質(zhì)水解非常緩慢，運(yùn)用化學(xué)手段清除PPi需要在高濃度的酸性介質(zhì)中，這顯然與弱堿性的PCR反應(yīng)條件存在很大的差異，而生物體內(nèi)擔(dān)負(fù)快速有效清除PPi的蛋白質(zhì)是無(wú)機(jī)焦磷酸酶(PPase)，其能夠?qū)Pi催化分解成磷酸根(P043_，Pi)，因此利用酶催化反應(yīng)，這一專一而高效的生物學(xué)手段，可以有效促進(jìn)PCR的效率。但PCR通常需要在60°C以上的高溫環(huán)境下進(jìn)行l(wèi)_3h，這就給PPase在PCR中的應(yīng)用帶來(lái)了挑戰(zhàn)。雖然可以在自然界，通過(guò)某些耐高溫的嗜熱菌中提取出具有耐高溫性質(zhì)的PPase，但是獲得，篩選，提取這類嗜熱微生物非常困難，對(duì)其培養(yǎng)和表達(dá)需要特殊環(huán)境要求，即便是已經(jīng)商品化的耐熱型酶，例如從嗜熱脂肪芽孢桿菌中提取的PPase，其酶活力也遠(yuǎn)低于通常用大腸桿菌提取的PPase。大腸桿菌作為常用的工程菌，從中提取的PPase酶活力超過(guò)800 units/mg,顯示其高活性的特點(diǎn)，但是其最適反應(yīng)溫度只有45_50°C左右，不僅無(wú)法達(dá)到PCR反應(yīng)溫度的要求，而且該蛋白質(zhì)在高溫條件下也容易變性失活，這就需要對(duì)大腸桿菌的PPase進(jìn)行改性以提高其最適反應(yīng)溫度以及耐熱性，對(duì)于促進(jìn)PCR效率具有很大的潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種增強(qiáng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)效率的策略，利用聚合物-蛋白質(zhì)偶聯(lián)技術(shù)，在無(wú)機(jī)焦磷酸酶(PPase)活性中心附近定位修飾上溫度響應(yīng)性聚合物聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)，增強(qiáng)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性以適應(yīng)PCR高溫長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)的條件，利用自身催化分解焦磷酸的能力，達(dá)到增強(qiáng)PCR的效果。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案:一種新型溫度響應(yīng)性無(wú)機(jī)焦磷酸酶偶聯(lián)物(PN1-PPase)的合成方法，其特征在于，包括以下步驟:
(1)定點(diǎn)突變構(gòu)建無(wú)機(jī)焦磷酸酶突變體:通過(guò)將無(wú)機(jī)焦磷酸酶活性中心附近引入巰基，得到無(wú)機(jī)焦磷酸酶突變體；
(2)制備溫度響應(yīng)性聚合物聚N-異丙基丙烯酰胺:控制N-異丙基丙烯酰胺單體與鏈轉(zhuǎn)移劑的投料比，聚合得到不同分子量的聚N-異丙基丙烯酰胺聚合物；
(3)制備硫代吡啶基團(tuán)的聚合物:在所述聚合物末端修飾上硫代吡啶基團(tuán)；
(4)制備聚N-異丙基丙烯酰胺-無(wú)機(jī)焦磷酸酶偶聯(lián)物(PN1-PPase):控制修飾有硫代吡啶基團(tuán)的聚合物與無(wú)機(jī)焦磷酸酶突變體的比例，通過(guò)硫代吡啶與無(wú)機(jī)焦磷酸酶突變體活性中心附近的巰基進(jìn)行反應(yīng)得到偶聯(lián)物(PN1-PPase )。
[0006]進(jìn)一步，步驟(I)中的巰基是通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)引入的，即將無(wú)機(jī)焦磷酸酶活性中心附近引入半胱氨酸巰基，從而使得無(wú)機(jī)焦磷酸酶活性中心附近引入巰基。
[0007]進(jìn)一步，步驟(2)中的聚合反應(yīng)為可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合反應(yīng)。
[0008]進(jìn)一步，步驟(3 )中，修飾上硫代吡啶基團(tuán)的聚合物是向步驟(2 )中的聚N-異丙基丙烯酰胺聚合物內(nèi)加入乙醇胺和二硫代二吡啶后得到的。
[0009]進(jìn)一步，獲得偶聯(lián)物(PN1-PPase)，并測(cè)定其在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀循環(huán)不同次數(shù)下的活性變化，包括以下步驟:
(1)將偶聯(lián)物(PN1-PPase)放置于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀中循環(huán)20-100次；
(2)以焦磷酸鈉(Na4P2O7)為底物，測(cè)定偶聯(lián)物在不同循環(huán)次下的活性變化情況。
[0010]本發(fā)明的第二種技術(shù)方案為:一種將偶聯(lián)物(PN1-PPase)應(yīng)用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法，其特征在于:將偶聯(lián)物(PN1-PPase)加入聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中，以增強(qiáng)促進(jìn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的效率。
[0011]進(jìn)一步，將偶聯(lián)物(PN1-PPase)加入到聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中，用于促進(jìn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的效率，其特征在于，包括以下步驟:
(1)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中加入偶聯(lián)物(PN1-PPase)，在體系中循環(huán)若干次；
(2)擴(kuò)增后的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行表征。
[0012]本發(fā)明的第三種技術(shù)方案為:一種偶聯(lián)物(PN1-PPase)在不同溫度下的活性測(cè)定以及不同時(shí)間下的熱穩(wěn)定性測(cè)定，包括以下步驟:
(1)測(cè)定偶聯(lián)物(PN1-PPase)在25_90°C的比活值:選用焦磷酸鈉(Na4P2O7)作為底物，測(cè)定偶聯(lián)物(PN1-PPase) —定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的磷酸根含量，計(jì)算出相應(yīng)溫度下的比活值；
(2)測(cè)定偶聯(lián)物(PN1-PPase)在60°C左右溫度下的熱穩(wěn)定性情況:在60°C下分別熱處理不同時(shí)間，測(cè)定偶聯(lián)物(PN1-PPase)的活性變化情況。
[0013]進(jìn)一步，還包括一種篩選后并應(yīng)用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法，包括以下步驟，選取所述測(cè)定后熱穩(wěn)定性表現(xiàn)最好的偶聯(lián)物(PN1-PPase)，將其加入聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中，并在所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中循環(huán)若干次。
[0014]一種新型溫度響應(yīng)性無(wú)機(jī)焦磷酸酶偶聯(lián)物的合成及其在增強(qiáng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的應(yīng)用，包括以下步驟:
(I)調(diào)節(jié)NIPAM與鏈轉(zhuǎn)移劑(CTA)的比例制備出不同分子量的聚合物PNIPAM，并修飾上硫代R比啶基團(tuán)，與PPase活性中心附近的巰基進(jìn)行共價(jià)結(jié)合制備出PN1-PPase偶聯(lián)物。
[0015](2)分別將所得偶聯(lián)物進(jìn)行25-90°C的活性測(cè)試以及60°C下10_180min的熱穩(wěn)定性測(cè)試。
[0016](3)將熱穩(wěn)定性表現(xiàn)最好的偶聯(lián)物加入到PCR反應(yīng)體系中，通過(guò)20次循環(huán)后，研宄PCR擴(kuò)增效率情況。
[0017](4)將熱穩(wěn)定性表現(xiàn)最好的偶聯(lián)物放置于PCR儀中循環(huán)熱處理20-100次后，對(duì)其活性進(jìn)行測(cè)試。
[0018]本發(fā)明原理:通過(guò)在PPase活性中心定位共價(jià)修飾上溫度響應(yīng)性聚合物PNIPAM，通過(guò)PNIPAM在高溫下對(duì)活性中心結(jié)構(gòu)的保護(hù)和穩(wěn)定作用，增強(qiáng)蛋白質(zhì)在高溫下的耐熱性，以適應(yīng)PCR的長(zhǎng)時(shí)間的高溫環(huán)境，使其發(fā)揮自身能夠催化分解PPi的能力，從而達(dá)到對(duì)PCR的增強(qiáng)效果。
[0019]由于上述技術(shù)方案的應(yīng)用，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出特點(diǎn):
本發(fā)明所述技術(shù)方案中，采用了酶這一專一高效的催化劑，來(lái)分解PPi，傳統(tǒng)用高濃度酸性介質(zhì)分解PPi與PCR堿性條件存在很大差異。
[0020]本發(fā)明所述技術(shù)方案中，采用了聚合物-蛋白質(zhì)偶聯(lián)技術(shù)，有效提高蛋白質(zhì)的最適反應(yīng)溫度以及耐熱性。與從嗜