一種高純度辣椒基因組dna提取技術(shù)的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于應(yīng)用生物技術(shù)育種領(lǐng)域，其主要內(nèi)容是從作為辣椒育種親本的雜種材 料中提取高純度基因組DNA。其特點(diǎn)是以操作簡便、重復(fù)性好、純度高的DNA為樣品實(shí)施分 子標(biāo)記，并在辣椒雜交育種、親本配合力的選擇上獲得遺傳型穩(wěn)定可靠、雜種優(yōu)勢明顯的雜 種一代。本專利采用一種特有的技術(shù)方法提取和純化用以辣椒基因組學(xué)和親本雜種優(yōu)勢鑒 定的DNA。 技術(shù)背景
[0002] 辣椒（C. annuum)是一種廣泛種植的茄科作物，基因組學(xué)的研宄是辣椒新品種培 育的一種重要的生物學(xué)基礎(chǔ)。應(yīng)用基因組學(xué)的差異比較和功能基因的序列分析可以有效的 分離和鑒定不同品種的親緣關(guān)系及其親本雜交的遺傳配合力。辣椒雜交種的雜種優(yōu)勢主要 來源于雜合基因間的相互作用，其遺傳學(xué)基礎(chǔ)在于雙親間的遺傳差異。DNA分子標(biāo)記的發(fā) 展為雜種優(yōu)勢預(yù)測提供了新的手段。直接以DNA結(jié)構(gòu)多態(tài)性為基礎(chǔ)建立的遺傳標(biāo)記，在植 物的各個組織、各個發(fā)育階段均可檢測，不受季節(jié)和環(huán)境限制。以DNA為標(biāo)記的分子鑒定技 術(shù)具有操作簡便、重復(fù)性好、穩(wěn)定可靠等特點(diǎn)在植物育種上的應(yīng)用甚為廣泛。例如，辣椒抗 黃瓜花葉病毒（CMV)的抗性是受多個基因性狀控制的，符合加性顯性遺傳模型。華中農(nóng)業(yè) 大學(xué)的姚明華（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報2013)對6份抗感差異的辣椒材料，采用完全雙列雜交 的方法對其抗CMV的遺傳力和配合力等遺傳參數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，辣椒對黃瓜花葉病 毒株系CMV-HB的抗性由多基因控制，以加性效應(yīng)為主；并且抗性的正反交效應(yīng)不顯著，表 明配制雜交組合要選擇雙親均具較高抗性的親本。吳立東（2011)以福建省三明市農(nóng)科所 收集的34份具有較高利用價值的辣椒種質(zhì)資源為研宄材料，采用SRAP分子標(biāo)記分析了 34 份辣椒種質(zhì)資源的遺傳多樣性，并基于分子聚類結(jié)果選出11個親本材料，按不完全雙列雜 交設(shè)計(jì)（5X6)組配成一套包括辣椒親本和雜種一代2個世代的遺傳材料，分析計(jì)算遺傳距 離與雜種優(yōu)勢。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用30對引物組合進(jìn)行相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性分析（即，SRAP擴(kuò)增）， 其中有28個引物組合可以獲得多態(tài)性擴(kuò)增，共擴(kuò)增出356條帶，其中多態(tài)性條帶298條，多 態(tài)性條帶比例83. 7%。擴(kuò)增出的DNA帶的大小在200~3000bp之間。SRAP標(biāo)記可明顯區(qū) 分34個辣椒自交系材料的基本類型即長椒（C. f. var. Iongum Sent)和燈籠椒（C. f. var. grossum Sent)。這些研宄表明以辣椒基因組學(xué)為基礎(chǔ)的雜交品種的培育必須基于DNA的 提取、PCR擴(kuò)增以及核苷酸序列的差異性比較才能夠達(dá)到分子水平上的鑒定和區(qū)別。為了 獲得高度純化、高質(zhì)量的DNA，采用一種特有的技術(shù)方法提取和純化用以辣椒基因組學(xué)和雜 種優(yōu)勢鑒定的DNA是本專利的主要技術(shù)內(nèi)容。其特點(diǎn)是，1)使用聚乙烯基吡咯烷酮用以提 取液中的DNA的提??；2)使用山梨醇作為辣椒DNA提取液的組成成分；3)使用十二烷基肌 氨酸作為DNA裂解液的主要組成成分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 辣椒雜交種的雜種優(yōu)勢主要來源于雜合基因間的相互作用，其遺傳學(xué)基礎(chǔ)在于雙 親間的遺傳差異，也就是DNA的核苷酸序列的多態(tài)性。以DNA的核苷酸序列差異為標(biāo)記的 分子鑒定技術(shù)，具有操作簡便、重復(fù)性好、穩(wěn)定可靠等特點(diǎn)。專利發(fā)明的目的就是通過辣椒 高純度基因組DNA的提取與純化技術(shù)的應(yīng)用，在辣椒雜交育種、親本配合力的選擇上獲得 遺傳型穩(wěn)定可靠、雜種優(yōu)勢明顯的親本材料和一代雜種。本專利發(fā)明采用一種特有的技術(shù) 方法提取和純化辣椒基因組DNA。其主要內(nèi)容是：
[0004] 1、辣椒葉片細(xì)胞的溫浴裂解：辣椒葉片用液氮研磨后放入EP離心管中，加入 600ul EB 提取液（0. 35M 山梨醇、0. 2% 聚乙烯基吡咯烷酮（PVP)，0.1 M Tris-HCl、0. 005M EDTA，ρΗ7· 5) 65°C 溫浴 20 分鐘。
[0005] 2、葉片細(xì)胞的離心再裂解：14000rpm離心（4°C )10分鐘，棄上清液，加入600ul 裂解液（0.2M Tris-HC1、0.05M EDTA，0.5M NaCl，2%CTAB 和 5%十二烷基肌氨酸鈉， pH7. 5)65°C 溫浴 40 分鐘。
[0006] 3、使用裂解液的核酸分離：加入氯仿、異戊醇（24 : l)250ul，顛倒混勻；12000rpm 離心（4 °C ) 20分鐘，取上清液。
[0007] 4、針對提取液的核酸分離：加入氯仿、苯酚：異戊醇（24 : 25 : l)250ul，顛倒混 勻；12000rpm離心（4°C )10分鐘，取上清液。重復(fù)一次。
[0008] 5、針對提取液的核酸純化：加入異丙醇（_20°C保存）400ul以及4ul醋酸鈉 (3M)，-20°C靜置30分鐘。12000rpm離心（4°C ) 10分鐘，棄上清液。
[0009] 6、樣品核酸的純化溶解：沉淀加入70%乙醇，12000rpm離心（4°C ) 10分鐘，棄上 清液。沉淀吹干，加入TE 60ul。-20°C保存。
[0010] 7、樣品DNA的質(zhì)量標(biāo)定：用紫外分光光度計(jì)測定所提取的辣椒DNA的A260/A280 值，純度較高，可以達(dá)到1. 9左右。經(jīng)過A260值計(jì)算，DNA的含量可以達(dá)到400-500ng/ul。
[0011] 與其它植物基因組DNA的提取方法不同，該方法的特點(diǎn)是在提取液中加入了 0. 35M山梨醇和聚乙烯基吡咯烷酮（PVP)、在裂解液中加入了十二烷基肌氨酸鈉，以及在核 酸的純化中加入了醋酸鈉。這些化學(xué)成分的加入，使得辣椒細(xì)胞的裂解過程減少了酚類化 合物對核酸裂解的干擾，有效地保護(hù)了基因組大片段的DNA鏈，有助于辣椒基因組的核酸 大片段DNA的穩(wěn)定和保存，有利于DNA的核苷酸差異序列的PCR擴(kuò)增和分子鑒定。三者缺 一不可。
[0012] "一種辣椒基因組高純度DNA提取技術(shù)"的專利發(fā)明僅僅適用于辣椒細(xì)胞核基因組 大片段DNA的提取，并應(yīng)用于不同辣椒親本以及雜種一代DNA的核苷酸差異的PCR擴(kuò)增和 分子鑒定。為保障所提取的DNA鏈的長度的完整性以及DNA片段的高純度，該專利發(fā)明體現(xiàn) 了純化獲得的基因組DNA的四大特點(diǎn)：1)使用PVP用以提取液中的DNA的提?。?)使用山 梨醇作為辣椒DNA提取液的組成成分；3)使用十二烷基肌氨酸鈉作為DNA裂解液的主要組 成成分。4)純化所獲得的DNA純度高、質(zhì)量好，含量達(dá)到500ng/ul，A260/280值為1. 8-2. 0 之間。 具體實(shí)施例
[0013] 1、提取DNA的辣椒材料：辣椒103號父本、辣椒103號母本、103F12006-1、 103F12011-2,辣椒 106