一種新的包含多個(gè)耐藥基因盒的整合子的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)及耐藥細(xì)菌監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，涉及一種新發(fā)現(xiàn)的與非傷寒沙 門(mén)氏菌耐藥性密切相關(guān)的整合子。
【背景技術(shù)】
[0002] 由沙門(mén)氏菌引起的感染疾病呈全球性分布，近年來(lái)發(fā)病率明顯上升，多見(jiàn)于嬰幼 兒。加之沙門(mén)氏菌可通過(guò)質(zhì)粒介導(dǎo)而對(duì)多種抗生素耐藥，已成為流行病學(xué)中一個(gè)值得重視 的問(wèn)題。本病全年均可發(fā)病，但多發(fā)生于夏秋季，有起病急、潛伏期短、集體發(fā)病等流行特 征。病后免疫力不強(qiáng)，可反復(fù)感染。沙門(mén)氏菌特別是非傷寒沙門(mén)氏菌的耐藥問(wèn)題已成為影 響人類(lèi)健康的一個(gè)非常重要因素。
[0003] 整合子（integron)是一種可以通過(guò)捕獲的外源基因，并將其轉(zhuǎn)化為功能基因的 DNA片段，定位于染色體、轉(zhuǎn)座子或質(zhì)粒上，并可在其間流動(dòng)。主要見(jiàn)于革蘭陰性菌，以I類(lèi) 整合子的發(fā)現(xiàn)在革蘭陰性菌中分布最廣。I類(lèi)整合子的基本結(jié)構(gòu)由3部分組成，兩端是高度 保守序列，分別稱(chēng)作5'保守端（5' -CS)和3'保守端（3' -CS)，5' -CS長(zhǎng)約I. 4kb，3' -CS長(zhǎng) 約2kb，5 ' -CS和3 ' 一 CS之間的區(qū)域稱(chēng)作可變區(qū)，可變區(qū)由一個(gè)或多個(gè)基因盒組成，基因盒 一般含抗菌藥物耐藥基因。整合子是一種可移動(dòng)的基因元件，位于細(xì)菌的質(zhì)?；蛉旧w上， 可攜帶多個(gè)抗菌藥物耐藥基因，并能引起耐藥基因的高效、快速轉(zhuǎn)移，造成同種或不同菌種 之間的擴(kuò)散，從而表達(dá)對(duì)不同抗生素的多重耐藥性。
[0004] 深入研宄沙門(mén)氏菌耐藥機(jī)制特別對(duì)有關(guān)整合子的研宄，可加強(qiáng)對(duì)感染菌株的流行 病學(xué)的了解，有利于抗菌藥物的合理使用和新抗生素藥物的開(kāi)發(fā)；同時(shí)，加強(qiáng)抗菌藥物的合 理應(yīng)用，可減少整合子發(fā)生、減少分子進(jìn)化的外部誘導(dǎo)環(huán)境，延緩多藥耐藥菌株的發(fā)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種含有耐藥基因盒的整合子，將其命名為Inl086,其序列如SEQ ID NO. 1所示。該整合子含有aacA4基因盒、基因盒、catB3基因盒、arr-3基因盒、 dfrA27基因盒和aadA16基因盒。上述整合子表達(dá)多種耐藥基因，從而導(dǎo)致含有該整合子的 菌種對(duì)多種抗生素藥物具有耐藥性。這些抗生素包括：氨基糖苷類(lèi)抗生素、β內(nèi)酰胺類(lèi)抗 生素、磺胺類(lèi)抗生素、氯霉素類(lèi)抗生素、大觀霉素類(lèi)抗生素以及利福平類(lèi)抗生素。
[0006] 常見(jiàn)的氨基糖苷類(lèi)抗生素包括：鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡 星。
[0007] 常見(jiàn)的β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素包括：青霉素、頭孢菌素、碳青霉烯類(lèi)，以及新發(fā)展的頭 霉素類(lèi)、硫霉素類(lèi)、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類(lèi)等其他非典型β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素。
[0008] 常見(jiàn)的磺胺類(lèi)抗生素包括：磺胺異惡唑（SIZ)、磺胺二甲嘧啶（SM2)、磺胺嘧啶 (SD)、磺胺甲惡唑（SMZ)、磺胺間甲氧嘧啶（SMM)、柳氮磺吡啶（SASP)、磺胺米?。⊿ML)、磺胺 嘧啶銀、磺胺醋酰（SA)、以及復(fù)方新諾明（甲氧芐啶+磺胺甲惡唑）。
[0009] 常見(jiàn)的氯霉素類(lèi)抗生素包括：氯霉素、琥珀酸氯霉素。
[0010] 常見(jiàn)的大觀霉素類(lèi)抗生素包括：大觀霉素、觀霉素、奇霉素。
[0011] 常見(jiàn)的利福平類(lèi)抗生素包括：利福平、利福噴汀。
[0012] 本發(fā)明的整合子是通過(guò)以下方法獲得的：
[0013] (1)在臺(tái)州市立醫(yī)院感染科科病人血液培養(yǎng)陽(yáng)性的標(biāo)本中分離出1株對(duì)頭孢曲 松、阿米卡星、復(fù)方新諾明耐藥的細(xì)菌。
[0014] (2)然后將分離的單克隆菌株按操作程序用VITEK 2和藥敏平板瓊脂擴(kuò)散方法 (補(bǔ)充藥敏紙片）進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)，經(jīng)鑒定此菌株為非傷寒沙門(mén)氏菌將其命名為 Nsa292。同時(shí)，試驗(yàn)證實(shí)此菌株對(duì)多種抗生素有顯著耐藥性。
[0015] (3)將Nsa292菌株培養(yǎng)擴(kuò)增，提取所述耐藥菌株的質(zhì)粒。
[0016] (4)將步驟（3)提取純化后的質(zhì)粒使用BamHI酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離得到一段 長(zhǎng)度為6, 667bp的DNA片段，將該DNA片段以常規(guī)方法與pMD19-T載體連接，然后熱激轉(zhuǎn)化 法轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E. coli T0P10中，以藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，測(cè)序。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種含有整合子Inl086序列的重組質(zhì)粒。所述質(zhì)粒包含整合子 Inl086序列。在本發(fā)明的具體的實(shí)施方案中，所述重組質(zhì)粒由整合子Inl086序列和pET32a 載體重組而成，整合子插入位點(diǎn)在pET32a載體上BamHI酶切位點(diǎn)處。所述重組質(zhì)粒使用的 空載體可以使用任何常見(jiàn)的質(zhì)粒載體代替。所述重組質(zhì)粒的方法也為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知 的常規(guī)方法。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種含有整合子Inl086的接合菌株。為了研宄整合子的耐藥性， 本發(fā)明利用細(xì)菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)鑒定整合子Inl086的功能，將Nsa292菌株與E. coli J53 Azk(對(duì)疊氮化鈉耐藥）菌株共培養(yǎng)，通過(guò)含疊氮化鈉（300mg/L)和阿米卡星（0. 06mg/ L)平板篩選接合子，將接合子做藥敏試驗(yàn)，受體菌擁有供體菌的耐藥性。其中，所用阿米卡 星可用下列藥物代替：氨曲南、妥布霉素、丁胺卡拉、慶大霉素、頭孢替坦、頭孢唑林、頭孢吡 肟、頭孢他啶、頭孢曲松、亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦（舒普深）、復(fù) 方新諾明。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種含有整合子Inl086的重組菌株。為進(jìn)一步證實(shí)上述接合 菌株的抗性來(lái)源于Nsa292菌株中的整合子，本發(fā)明將該整合子Inl086克隆入pET32a載 體中，整合子插入位點(diǎn)在pET32a載體上BamHI酶切位點(diǎn)處。并將其轉(zhuǎn)化入野生型E. coli JM109中，通過(guò)含有Amp的平板選陽(yáng)性克?。ê衟ET32a-整合子的細(xì)菌）。將陽(yáng)性克隆做 藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示Nsa292菌株中的整合子Inl086可以使重組E. coli JM109菌株對(duì)以下 藥物耐藥：氨曲南、阿米卡星、妥布霉素、丁胺卡拉、慶大霉素、頭孢替坦、頭孢唑林、頭孢吡 肟、頭孢他啶、頭孢曲松、亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦（舒普深）、復(fù) 方新諾明、氯霉素、大觀霉素。
[0020] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0021] (1)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了序列為SEQ ID NO. 1的包括多種耐藥基因盒的整合子 Inl086,該整合子的核苷酸序列在現(xiàn)有技術(shù)中未見(jiàn)報(bào)道。
[0022] (2)本發(fā)明整合子序列的發(fā)現(xiàn)，為臨床用藥提供了一定的指導(dǎo)作用。有利于臨床上 減少某些抗菌藥物的使用，降低該類(lèi)耐藥基因盒水平轉(zhuǎn)移的選擇壓力，防止耐藥細(xì)菌的爆 發(fā)性流行。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1為本發(fā)明的整合子Inl086的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0024] 具體的實(shí)施方式
[0025] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，本發(fā)明的實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明， 并不意味著限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如sambrook等人， 分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所描 述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0027] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0028] 實(shí)施例1整合子Inl086的鑒定
[0029] l、Nsa292菌株的分離和鑒定
[0030] I. 1 材料
[0031] 細(xì)菌藥敏卡：法國(guó)bioMerieux的AST-GN13。AST-GN13藥敏種類(lèi)有：阿米卡星、氨 芐西林、氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、頭孢唑啉、頭孢吡肟、頭孢替