姜黃素類化合物SULTs代謝指紋圖譜構建方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種藥物代謝酶代謝指紋圖譜的構建方法及其應用，具體是SULTs催 化的姜黃素類化合物磺酸化結合反應指紋圖譜的構建方法及其應用。屬于醫(yī)藥技術領域。
【背景技術】
[0002] 姜黃素類化合物是從姜科姜黃屬植物中提取的一類主要活性成分，主要來源是姜 黃、莪術、郁金等常用中藥。多項研宄顯示，姜黃類化合物在治療癌癥、免疫缺陷、心血管疾 病、阿爾茲海默病、糖尿病、關節(jié)炎、crohn' s病和潰瘍性結腸炎等疾病具有良好的藥理作 用。姜黃素類化合物的母核為二苯基庚二酮，根據苯環(huán)上有無羥基可分為酚性和非酚性兩 類。目前已分離出20余種姜黃素類化合物，其中姜黃素（c UrcUmin，CUR)、去甲氧基姜黃素 (demethoxycurcumin，DMC)、雙去甲氧基姜黃素（bisdemethoxycurcumin，BDMC)是最主要 的有效成分。這三種化合物相近的結構使它們具有多方面相似的藥理作用，如抗炎、抗氧 化、清除自由基和降血脂等。但是結構上的微小差異又使三種姜黃素在抗癌、抗氧化作用等 方面的能力有較大差異。例如抑制TPA引起的癌細胞增生去甲氧基姜黃素最佳，其次是姜 黃素；防止細胞脂類過氧化物的形成則是雙去甲氧基姜黃素最佳，其次是去甲氧基姜黃素。 可見，姜黃素類化合物正日益引起人們的重視，成為研宄的熱點。然而，該類化合物在體內 較弱的吸收和快速的藥物代謝，導致其口服生物利用度極低，這也給姜黃素類化合物的新 藥研制和在臨床中的廣泛應用造成了巨大困難。因此，詳細解析姜黃素類化合物的代謝途 徑和過程，有助于提高其生物利用度、進一步闡明其解毒途徑以及藥物相互作用等機制，為 該類藥物新藥開發(fā)提供有力支持，并為其在臨床上安全、合理、有效地應用提供理論依據和 科學指導。
[0003] 由磺基轉移酶（Sulfotransferases，SULTs)催化的II相代謝磺酸化結合反應是 姜黃素類化合物生物轉化的重要途徑。因此，明確姜黃素類化合物的SULTs代謝指紋圖譜 及其應用具有重要的意義。
[0004] 人類 SULT 基因家族主要有：SULTI，SULT2，SULT4 和 SULT6。
[0005] SULTs催化底物與輔因子3' -磷酸腺苷-5' -磷酸硫酸鹽（3' -phosphoadenosiri e-5'_phosphosulfate, PAPS)結合，從而增加底物的親水性，使其能更有效地從尿液或膽汁 中排出體外。本發(fā)明應用重組SULTs構建姜黃素類化合物的SULTs代謝指紋圖譜。

【發(fā)明內容】

[0006] 發(fā)明目的：
[0007] 本發(fā)明提供了姜黃素類化合物SULTs代謝指紋圖譜構建方法及應用。該指紋圖譜 可用于描述和預測姜黃素類化合物的磺酸化結合反應代謝特性及作用，對姜黃素類化合物 的藥用研發(fā)及其臨床安全、合理、有效應用提供理論支持和科學指導。
[0008] 技術方案：
[0009] 本發(fā)明以姜黃素類化合物為底物，該類底物是從姜科植物中提取的有效成分，其 結構式見圖I，其中&和R2是-OCH 3或-H基團。采用重組SULTs并借助其體外孵育體系催 化姜黃素類化合物的磺酸化結合反應，通過定量檢測單位時間內的磺酸化結合產物的生成 量或其底物消除量來獲得其生物活性，并建立SULTs的指紋圖譜。具體指紋圖譜的方法建 立步驟為：
[0010] (1)分別建立重組SULTs與姜黃素類化合物的反應體系：根據底物的性質確定反 應體系中底物的濃度、酶及PAPS的用量，其中底物濃度選擇介于1/10~IOKni之間。
[0011] (2)嚴格控制反應體系的反應溫度介于25°C至55°C之間，優(yōu)選37°C為最優(yōu)反應時 間；孵育體系的PH介于5. 0-8. 5之間；控制反應時間以確保上述底物的磺酸化結合產物的 轉化率不超過30%。
[0012] (3)根據底物性質和檢測方法選用乙腈終止反應。
[0013] (4)采用適宜的檢測方法，測定體系中單位時間內底物消除量或其磺酸化產物的 生成量，計算底物磺酸化結合反應的反應速率并以此評價磺基轉移酶的生物活性。
[0014] 步驟（1)中的SULTs是指所有重組的磺基轉移酶產品。
[0015] 步驟（3)、（4)的檢測方法包括紫外吸收光譜、質譜、放射性同位素示蹤技術、薄層 色譜、熒光激發(fā)光譜、蒸發(fā)光散射光譜及電化學光譜等。具體檢測過程可以單一方法或多種 方法聯(lián)合應用。
[0016] 優(yōu)點及效果：
[0017] 本發(fā)明所述的SULTs指紋圖譜的建立，具有以下突出優(yōu)勢：
[0018] (1)高特異性姜黃素類化合物可被SULTs高特異地代謝為相應的磺酸化結合產 物，沒有其它代謝產物干擾。
[0019] (2)方便快捷該酶促反應體系簡便，易于操作和控制，通過計算底物磺酸化結合反 應的反應速率即可快速獲得底物的SULTs指紋圖譜。
[0020] (3)檢測靈敏姜黃素類化合物具有良好的紫外吸收特性和離子化效果，可以通過 常規(guī)分析方法和儀器進行檢測，具有很高的靈敏度、分離度和分析速度。
[0021] 本發(fā)明應用代謝指紋圖譜可以預測化合物的主要代謝器官、代謝程度以及在靶組 織中的代謝順序等等；可以預測化合物潛在的藥物相互作用以及基因多態(tài)性的影響；還有 助于構效關系的測定；等等。
【附圖說明】
[0022] 圖1姜黃素類化合物的基本結構式；
[0023] 圖2姜黃素（CUR)、去甲氧基姜黃素（DMC)、雙去甲氧基姜黃素（BDMC)結構式；
[0024] 圖3姜黃素（⑶R)及其磺酸化結合反應代謝產物色譜圖；
[0025] 圖4去甲氧基姜黃素（DMC)及其磺酸化結合反應代謝產物色譜圖；
[0026] 圖5雙去甲氧基姜黃素（BDMC)及其磺酸化結合反應代謝產物色譜圖；
[0027] 圖6雌二醇（內標）色譜圖；
[0028] 圖7 SULTs催化姜黃素（CUR)磺酸化結合反應的指紋圖譜；
[0029] 圖8 SULTs催化去甲氧基姜黃素（DMC)磺酸化結合反應的指紋圖譜；
[0030] 圖9 SULTs催化雙去甲氧基姜黃素（BDMC)磺酸化結合反應的指紋圖譜；
[0031] 圖10 SULT1A3催化的姜黃素（CUR)磺酸化結合反應的代謝活性圖譜；
[0032] 圖11 SULT1E1催化的DMC磺酸化結合反應的代謝活性圖譜；
[0033] 圖12 SULT1A2催化的雙去甲氧基姜黃素（BDMC)磺酸化結合反應的代謝活性圖 譜；
[0034] 圖13本發(fā)明的流程框圖。
【具體實施方式】
[0035] 下列實施例是為了進一步說明本發(fā)明，而不是要限制其范圍。
[0036] 實施例1
[0037] SULT1A3催化CUR磺酸化結合反應的的反應體系，以及由該方法所得的SULT1A3催 化⑶R的代謝活性。
[0038]