檢測(cè)kras基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物、試劑盒及其pcr方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)基因檢測(cè)領(lǐng)域，特別提供了一種檢測(cè)KRAS基因熱點(diǎn)突變 位點(diǎn)的引物、試劑盒及其PCR方法。
【背景技術(shù)】
[0002] RAS基因家族與人類腫瘤密切相關(guān)的基因有三種--HRAS、KRAS和NRAS，分別定 位于11、12和1號(hào)染色體上。KRAS基因編碼21kDa的KRAS蛋白，又名p21基因。在RAS基 因家族中，KRAS對(duì)人類癌癥影響最大，它就像一個(gè)分子開(kāi)關(guān)，在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及血管生成等 過(guò)程的信號(hào)傳導(dǎo)通路中起著重要的調(diào)控作用，正常的KRAS基因可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，而一 旦發(fā)生突變，則不能產(chǎn)生正常的KRAS蛋白，使細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)紊亂，細(xì)胞增殖失控而癌變。
[0003] KRAS突變基因是常見(jiàn)的致癌基因，其突變可見(jiàn)于多種惡性腫瘤，結(jié)直腸癌患者中 約有30%~40%存在KRAS基因突變，肺癌患者中約有15%~30%存在突變。KRAS基因最常見(jiàn) 的突變方式為點(diǎn)突變，突變位點(diǎn)主要在2號(hào)外顯子的第12密碼子（G12S、G12R、G12C、G12D、 G12A、G12V)、13 密碼子（6135、6131?、613(：、6130、6134、613￥)和3號(hào)外顯子的第61密碼子 (061K、061L、061H)，常見(jiàn)突變位點(diǎn)為12號(hào)和13號(hào)密碼子上，其中有7個(gè)突變熱點(diǎn)：G12C、 G12R、G12S、G12V、G12D、G12A、G13V/D，這7種突變占到了 90%以上。這將導(dǎo)致結(jié)直腸癌和 肺癌患者預(yù)后差，且對(duì)靶向藥物一一KRAS酪氨酸激酶抑制劑和抗KRAS抗體產(chǎn)生耐藥。
[0004] 酪氨酸激酶信號(hào)通路是腫瘤細(xì)胞主要信號(hào)通路，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡等 重要生理過(guò)程的調(diào)控。隨著基于KRAS信號(hào)通路開(kāi)發(fā)出的靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑 (KRAS-TKI)、抗KRAS單克隆抗體（mAb)的問(wèn)世，非小細(xì)胞肺癌和結(jié)直腸癌的治療進(jìn)入了靶 向治療時(shí)代。其中KRAS-TKI藥物在非小細(xì)胞肺癌臨床療效明顯，已被推薦為晚期患者的一 線藥物。然而KRAS基因突變與KRAS-TKI和mAb的耐藥性相關(guān)。結(jié)直腸癌患者中，若攜帶 KRAS突變，西妥昔單抗療效較野生型患者差。非小細(xì)胞肺癌患者中，若攜帶KRAS突變，吉非 替尼療效較野生型患者差。
[0005] KRAS基因突變檢測(cè)已被列入NCCN (美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)，National Comprehensive Cancer Network)中國(guó)版的結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南2011年版和非小細(xì)胞肺 癌臨床實(shí)踐指南2011年版，用以幫助醫(yī)生選擇對(duì)癌癥患者最有效的治療方案，大幅減少過(guò) 度治療所導(dǎo)致的治療費(fèi)用增加和不必要的毒副作用，實(shí)現(xiàn)真正意義上的個(gè)體化治療。
[0006] 目前對(duì)基因突變和基因多態(tài)性的檢測(cè)，常見(jiàn)有直接測(cè)序法；基因芯片雜交法； PCR-RFLP方法；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳分析法；PCR-SSCP ;PCR高分辨熔解曲線分析技 術(shù)；PCR-Taqman MGB (Minor Groove Binder)探針?lè)ǎ籄S-PCR 法；Cast-PCR 法等。這些方 法或多或少還存在儀器價(jià)格高，操作難度大，存在一定假陰性和假陽(yáng)性，檢測(cè)成本高，臨床 普及程度低，不能同時(shí)大規(guī)模檢測(cè)臨床標(biāo)本等缺點(diǎn)。
[0007] 如：1)直接測(cè)序法是突變分析的金標(biāo)準(zhǔn)，能發(fā)現(xiàn)已知和未知突變位點(diǎn)，但該法檢測(cè) 基因突變的靈敏度為20%(即目的基因的突變基因 DNA模板數(shù)占野生型DNA模板數(shù)的20%)。 同時(shí)還存在操作復(fù)雜，周期長(zhǎng)，分析速度慢，常需要2天的時(shí)間，而且該法是開(kāi)管操作，大大 增加污染的可能性，不適合對(duì)大規(guī)模標(biāo)本的檢測(cè)，同時(shí)還需要昂貴的儀器，存在在基層不易 實(shí)施等缺點(diǎn)。
[0008] 2)普通PCR-RFLP方法技術(shù)簡(jiǎn)便，價(jià)格便宜，適宜少量樣本的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，但RFLP 僅能檢測(cè)有酶切位點(diǎn)的突變，無(wú)酶切位點(diǎn)不能檢測(cè)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，還存在PCR產(chǎn)物污染導(dǎo)致 假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)，見(jiàn)[Mol Diagn Ther. 2010 Jun 1; 14(3) :163-9, United States Patent 20120135406]。
[0009] 3)芯片技術(shù)與傳統(tǒng)的儀器檢測(cè)方法相比具有高通量、微型化、自動(dòng)化等特點(diǎn)，適用 于全基因組突變掃描，不適宜單個(gè)基因的突變位點(diǎn)檢測(cè)，且精度低，價(jià)格昂貴。
[0010] 4) PCR高分辨熔解曲線分析技術(shù)，能高通量檢測(cè)基因的突變情況，試劑成本較低， 但因其熒光信號(hào)來(lái)自染料，特異性受到影響，而且檢測(cè)儀器是升級(jí)版的熒光PCR儀，價(jià)格高 昂，普及受限，見(jiàn)[Clin Chim ACqa. 2012 Nov 12;413(21-22):1781-5; United States Patent 20110045479]〇
[0011] 5) PCR-Taqman MGB探針?lè)ㄟm合已知突變位點(diǎn)，常常需要兩條探針，而Taqman MGB探針的合成價(jià)格是普通Taqman探針的幾倍，見(jiàn)[J Clin Microbiol. 2010 Aug;48(8) :2909-15 ;United States Patent 20090311679]，并且不能檢測(cè)樣本中的含量 較少（彡1，〇〇〇個(gè)中的1個(gè)）的等位基因或突變位點(diǎn)。
[0012] 6)PCR_SSCP法雖然簡(jiǎn)單，但該法是開(kāi)放性的檢測(cè)系統(tǒng)，容易造成PCR產(chǎn)物的污染， 而且操作步驟多，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。
[0013] 7)等位基因特異性引物PCR擴(kuò)增法（AS-PCR)，這一方法是目前檢測(cè)基因突變或 SNP最簡(jiǎn)單快速的方法（Wu D Y, Ugozzoli L, Pal B K, Wallace R B·，Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86:2757-2760)，其原理是引物3'末端堿基與模板的堿基錯(cuò)配，其PCR的 效率將會(huì)下降 IO3-IO6.6倍（Chen, X·，and Sullivan, P F, The Pharmacogeonomics Journal 2003，3，77-96)。盡管該方法的原理簡(jiǎn)單，但錯(cuò)配的引物，依然會(huì)發(fā)生非特異 性擴(kuò)增，擴(kuò)增情況視突變的類型和檢測(cè)位點(diǎn)周圍的堿基序列相關(guān)（Ayyadevara S, Thaden J J, Shmookler Reis R J·, Anal Biochem 2000; 284:11-18)，還與樣本中存在的等位 基因變量的影響。為了增加 AS-PCR的特異性，許多科學(xué)家做了很多努力。大量的實(shí)驗(yàn)證 明，該方法最關(guān)鍵的是設(shè)計(jì)與3'末端突變位點(diǎn)堿基互補(bǔ)或錯(cuò)配的兩條特異引物，引物設(shè) 計(jì)不好，將導(dǎo)致高背景的交叉擴(kuò)增，會(huì)導(dǎo)致較高的假陽(yáng)性。盡管不少人努力將這一弊端克 月艮，如報(bào)道的TaqMAMA方法，在3'倒數(shù)第二位或第三位上引入突變堿基，的確可以增加 反應(yīng)的特異性，但仍然無(wú)法完全消除假陽(yáng)性，而且在純合子與雜合子的判斷上，缺乏標(biāo)準(zhǔn)， 會(huì)出現(xiàn)混亂的情況，見(jiàn)[J Virol Methods. 2008 Nov;153(2):156-62;Genomics. 2004 Feb; 83 (2) :311-20]。簡(jiǎn)單的AS-PCR，通常采用PCR反應(yīng)結(jié)束后再進(jìn)行電泳，從有無(wú)反應(yīng) 條帶來(lái)判斷結(jié)果，這種方法雖然不需要昂貴的儀器，但電泳操作，增加了 PCR的污染機(jī)會(huì)， 而且耗時(shí)費(fèi)力。盡管有人對(duì)該方法作了改進(jìn)，采用熒光定量PCR技術(shù)，但得到的不是"全或 無(wú)"式的結(jié)果，總會(huì)有非特異性反應(yīng)的發(fā)生，即同樣的引物對(duì)野生型和突變型位點(diǎn)都會(huì)擴(kuò) 增，只是其得到的Ct (Cycle threshold)不同而已，因此就引入了 ACt的概念，即ACt= 野生Ct-突變Ct，但計(jì)算復(fù)雜，如要Λ Ct值大于純合子Ct值判為突變型純合子，Λ Ct值 小于雜合子Ct值，判為雜合子，ACt值的引入不僅增加了操作步驟，還會(huì)引起混亂，因?yàn)?ACt值的設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)無(wú)法準(zhǔn)確定位，不同人員的操作、不同的標(biāo)本和不同的檢測(cè)儀器都會(huì)有 不同的數(shù)字，給臨床應(yīng)用帶來(lái)很大的困難，實(shí)際應(yīng)用依然受限，見(jiàn)[中國(guó)專利CN101235415， CN101565742A]〇
[0014] 8)美國(guó)LIFE公司采用一種MGB封閉探針的方法，稱作Cast-PCR ( Competitive allele specific Taqman PCR)，用MGB探針將不檢測(cè)的位點(diǎn)封閉，然后用等位基因特異 引物熒光定量PCR的方法檢測(cè)目的位點(diǎn)，這雖然提高了檢測(cè)的特異性，但由于多加入一 條MGB封閉探針，勢(shì)必增加成本，對(duì)反應(yīng)效率多少會(huì)帶來(lái)干擾，見(jiàn)[Exp Mol Pathol. 2012 Jun; 92 (3) :275-80; United States Patent 20100221717 ;CN102428190A]。有人采用鎖 核酸（LNA) ( Plant Method 2007, 3 :2)或修飾的堿基（Anal Biochem. 2005, 340 :287-294) 的PCR引物，可以使得AS-PCR檢測(cè)靈敏度提高。然而，這些方法增加了分析的總體成本，并 需對(duì)反應(yīng)進(jìn)行深度優(yōu)化。
[0015] 目前，國(guó)內(nèi)已上市有注冊(cè)證的KRAS基因檢測(cè)試劑盒有如下幾種：1、北京雅康博生 物科技有限公司的"人KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）"，國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn)）字2013 第3400175號(hào)（變更批件）；2、蘇州工業(yè)園區(qū)為真生物醫(yī)藥科技有限公司的"人KRAS基因突 變檢測(cè)試劑盒（Taqman-ARMS法）"，國(guó)食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2013第3400363號(hào)（變更批件）； 3、北京雅康博生物科技有限公司的"人KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）"，國(guó)食藥 監(jiān)械（準(zhǔn)）字2013第3400175號(hào)（變更批件）；4、武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司的"人類 KRAS基因7種突變檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ?，國(guó)食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2014第3400124 號(hào)；5、基因科技（上海）有限公司的"人類KRAS基因12/13密碼子突變檢測(cè)試劑盒（焦磷 酸測(cè)序法）"，國(guó)食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2014第3400958號(hào)。
[0016] 國(guó)內(nèi)涉及KRAS基因突變檢測(cè)方法的專利大約有幾十種，方法基本上也都是熒光 PCR技術(shù)、液相芯片技術(shù)等，例如申請(qǐng)人蘇州工業(yè)園區(qū)為真生物醫(yī)藥科技有限公司申請(qǐng)的 名為KRAS基因突變的快速檢測(cè)的專利（專利號(hào)CN 101875972 A)、申請(qǐng)人武漢友芝友生物 制藥有限公司申請(qǐng)的KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法(專利號(hào)CN 102888466 A)、 申請(qǐng)人浙江大學(xué)申請(qǐng)的用于KRAS基因突變分型的ARMS-qPCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法（CN 102367478 A)、申請(qǐng)人廣州益善生物技術(shù)有限公司申請(qǐng)的名為一種KRAS基因突變檢測(cè)液相 芯片的專利(專利號(hào)CN 102234686 A)。
[0017] 焦磷酸測(cè)序技術(shù)在單一位點(diǎn)的質(zhì)量評(píng)估和序列信息，分析含有CpG位點(diǎn)的SNP，序 列信息中不同位點(diǎn)的頻率計(jì)算等方面具有優(yōu)勢(shì)，但是前處理比較麻煩，配套試劑昂貴。芯片 技術(shù)與傳統(tǒng)的儀器檢測(cè)方法相比具有高通量、微型化、自動(dòng)化等特點(diǎn)，適用于全基因組突變 掃描，不適宜單個(gè)基因的突變位點(diǎn)檢測(cè)，且精度低，價(jià)格昂貴。而普通的熒光定量PCR技術(shù) 對(duì)最為關(guān)鍵的位點(diǎn)特異