鑒定狂犬病、犬瘟熱、傳染性肝炎、細(xì)小病毒病、鉤端螺旋體病和弓形體病病原的成套產(chǎn)品的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中鑒定或輔助鑒定狂犬病、犬瘟熱、傳染性肝炎、細(xì)小病 毒病、鉤端螺旋體病和弓形體病病原的成套廣品。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著我國對外交流日益增多，出現(xiàn)旅客攜帶伴侶犬的出入境數(shù)量及種類不斷增 加；觀賞犬、伴侶犬、工作犬以及實(shí)驗(yàn)用犬的國際貿(mào)易近年來發(fā)展迅速，我國舉辦各種國際 犬業(yè)會展和比賽越來越頻繁。同時，由于我國擁有世界最大的皮毛成衣出口基地一一香港， 對于我國大陸的皮毛供應(yīng)提出了更大需求。尤其是烏蘇里貉、白貉、銀狐、彩狐、藍(lán)狐和水貂 等毛皮動物及其毛皮產(chǎn)品，近年來有大量進(jìn)口。
[0003] 犬、狐、絡(luò)和紹不但可以攜帶危害犬類健康的病原體，也能攜帶傳播多種人畜共患 ?。豢蓴y帶傳播的疾病有狂犬病、犬瘟熱、傳染性肝炎和細(xì)小病毒病、鉤端螺旋體病、弓形體 病等。其中狂犬病、鉤端螺旋體病和弓形體病是人畜共患疾病，嚴(yán)重威脅人類健康；犬瘟熱、 犬傳染性肝炎和犬細(xì)小病毒病不但危害犬、狐、貉和貂的健康，還是虎、豹和熊貓等野生動 物的主要傳染病。特別是犬，為人類的親密接觸動物，加之動物可能來自不同的國家和地 區(qū)，疫情復(fù)雜，如不對出入境犬進(jìn)行嚴(yán)格檢疫，很有可能造成疫病傳入傳出國境，威脅人類 健康及動物衛(wèi)生。
[0004] 狂犬病是由狂犬病病毒（Rabiesvirus，RV)引起的一種專門侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)的 人獸共患傳染病，人發(fā)病后死亡率高達(dá)100%。據(jù)報道，全世界每年估計(jì)因狂犬病導(dǎo)致死亡 的人數(shù)為4萬-7萬，這些病例絕大多數(shù)發(fā)生在發(fā)展中國家，其中98%在亞洲。我國是狂犬 病的高發(fā)地區(qū)，人的狂犬病病死數(shù)位居世界第二，僅次于印度。據(jù)國家疾病控制中心發(fā)布的 疫情報告，自2002年以來每年因該病死亡的人數(shù)均超過2000人，這些數(shù)據(jù)突顯出狂犬病對 公共衛(wèi)生安全有嚴(yán)重的威脅。
[0005] 弓形蟲?。═oxoplasmosis)是由剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii，Tox)引起的一 種重要的機(jī)會感染性寄生蟲病，該疾病對人類特別是孕婦和胎兒具有嚴(yán)重的危害。
[0006] 鉤端螺旋體?。↙eptospirosis，鉤體?。┦鞘澜绶秶鷥?nèi)廣泛存在的熱帶病，尤其 在濕熱的熱帶和亞熱帶地區(qū)較為流行。致病性鉤端螺旋體（Pathogenic Leptospira)通過 粘膜或者傷口感染宿主后，迅速進(jìn)入血流并擴(kuò)散到肺、肝、腎及其他組織器官。不同致病性 鉤體感染宿主的臨床癥狀復(fù)雜，包括眼結(jié)膜充血，腹瀉，黃疽，腎衰和腦膜炎等。
[0007] 犬瘟熱（Canine distemper, CD)是犬瘟熱病毒（Canine distemper virus, CDV)弓丨 起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。犬瘟熱呈世界性分布，該病發(fā)病急、傳播速度快、 宿主廣泛、病毒感染力強(qiáng)、死亡率在30-80%，因此常帶來毀滅性損失，是養(yǎng)殖業(yè)重要傳染病 之一。調(diào)查顯示只要有經(jīng)濟(jì)動物養(yǎng)殖的地方均有過本病的發(fā)生。
[0008] 犬傳染性肝炎（Infectious canine hepatitis，ICH)是由犬傳染性肝炎病毒 (Infectious canine hepatitis virus，ICHV)引起的一種常見的急性敗血性傳染病。本 病多發(fā)生于1歲以內(nèi)的幼犬，死亡率高達(dá)40%。
[0009] 犬細(xì)小病毒病是犬的一種具有高度接觸性傳染的烈性傳染病。臨床上以急性出血 性腸炎和心肌炎為特征。犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus, CPV)，是引起犬出血性腸炎和幼 犬心肌炎的主要病原，具有高度的接觸傳染性。犬出血性腸炎和幼犬心肌炎的發(fā)病率和病 死率分別為20% -100%和10% -50%，給全球的養(yǎng)犬業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0010] 因此，目前迫切需要對狂犬病病毒（Rabiesvirus，RV)、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondi i，Tox)、鉤端螺旋體（Pathogenic Leptospira)、犬瘟熱病毒（Canine distemper virus, CDV)、犬傳染性肝炎病毒（Infectious canine hepatitis virus，ICHV)和犬細(xì)小病 毒（Canine parvovirus, CPV)這些病原的嚴(yán)格快速的檢疫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提高檢測狂犬病、犬瘟熱、傳染性肝炎、細(xì)小病毒 病、鉤端螺旋體病和弓形體病病原這六種病原的特異性、靈敏度、準(zhǔn)確性，并實(shí)現(xiàn)高通量檢 測。
[0012] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了鑒定或輔助鑒定病原的PCR引物對組合物。
[0013] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定病原的PCR引物對組合物，由名稱為rv的鑒定或 輔助鑒定狂犬病病毒的PCR引物對、名稱為tox的鑒定或輔助鑒定弓形蟲的PCR引物對、名 稱為Iep的鑒定或輔助鑒定鉤端螺旋體的PCR引物對、名稱為cdv的鑒定或輔助鑒定犬瘟 熱病毒的PCR引物對、名稱為ichv的鑒定或輔助鑒定犬傳染性肝炎病毒的PCR引物對和名 稱為cpv的鑒定或輔助鑒定犬細(xì)小病毒的PCR引物對組成；
[0014] 所述rv由序列表中SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的兩條單鏈DNA組成；
[0015] 所述tox由序列表中SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示的兩條單鏈DNA組成；
[0016] 所述1印由序列表中SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示的兩條單鏈DNA組成；
[0017] 所述cdv由序列表中SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示的兩條單鏈DNA組成；
[0018] 所述ichv由序列表中SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 14所示的兩條單鏈DNA組成；
[0019] 所述cpv由序列表中SEQ ID No. 16和SEQ ID No. 17所示的兩條單鏈DNA組成；
[0020] 所述病原為狂犬病病毒、弓形蟲、鉤端螺旋體、犬瘟熱病毒、犬傳染性肝炎病毒和 犬細(xì)小病毒這六種病原中的六種、五種、四種、三種、兩種或一種。
[0021] 其中，SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對名稱為rv， 可從狂犬病病毒（Rabiesvirus，RV)的總RNA中進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增得到272bp的DNA片段， SEQ ID No. 1由19個核苷酸組成，SEQ ID No. 2由20個核苷酸組成；
[0022] SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的兩條單鏈DNA組成的引物對名稱為tox，可從 剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii，Tox)的基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到189bp的DNA片 段，SEQ ID No. 4由18個核苷酸組成，SEQ ID No. 5由18個核苷酸組成；
[0023] SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示的兩條單鏈DNA組成的引物對名稱為1印，可從 鉤端螺旋體（Pathogenic Leptospira)的基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到146bp的DNA片 段，SEQ ID No. 7由18個核苷酸組成，SEQ ID No. 8由18個核苷酸組成；
[0024] SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示的兩條單鏈DNA組成的引物對名稱為cdv，可 從犬瘟熱病毒（Canine distemper virus, (DV)的總RNA中進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增得到218bp的 DNA片段，SEQ ID No. 10由18個核苷酸組成，SEQ ID No. 11由18個核苷酸組成；
[0025] SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 14所示的兩條單鏈DNA組成的引物對名稱為ichv， 可從犬傳染性肝炎病毒（Infectious canine hepatitis virus，ICHV)的基因組DNA中進(jìn) 行PCR擴(kuò)增得到258bp的DNA片段，SEQ ID No. 13由18個核苷酸組成，SEQ ID No. 14由 18個核苷酸組成；
[0026] SEQ ID No. 16和SEQ ID No. 17所示的兩條單鏈DNA組成的引物對名稱為cpv，可 從犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus, CPV)的基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到175bp的DNA 片段，SEQ ID No. 16由18個核苷酸組成，SEQ ID No. 17由18個核苷酸組成。
[0027] 上述鑒定或輔助鑒定病原的PCR引物對組合物中，所述rv、所述tox、所述lep、所 述cdv、所述ichv和所述cpv均可獨(dú)立包裝。
[0028] 上述鑒定或輔助鑒定病原的PCR引物對組合物中，所述rv、所述tox、所述lep、所 述cdv、所述ichv和所述cpv的兩條單鏈DNA均可獨(dú)立包裝。
[0029] 上述鑒定或輔助鑒定病原的PCR引物對組合物中，所述rv、所述tox、所述lep、所 述cdv、所述ichv和所述cpv的兩條單鏈DNA均可用生物素標(biāo)記。
[0030] 上述鑒定或輔助鑒定病原的PCR引物對組合物中，所述rv、所述tox、所述lep、所 述cdv、所述ichv和所述cpv的兩條單鏈DNA均可在其5'端用生物素標(biāo)記。
[0031] 上述鑒定或輔助鑒定病原的PCR引物對組合物中，所述rv和所述cdv可以單獨(dú) 使用，分別進(jìn)行單獨(dú)的RT-PCR，也可以組合使用進(jìn)行多重RT-PCR ;所述tox、所述1印、所述 ichv和所述cpv這四種引物對可以單獨(dú)使用分別進(jìn)行單獨(dú)的PCR，也可以組合使用進(jìn)行多 重PCR。這四種引物對組合使用的方式有多種，可以是其中任兩種引物對組合在一起使用， 也可以是其中任三種引物對組合在一起使用，也可以是四種引物對組合在一起使用。
[0032] 這六種引物對單獨(dú)使用時，本申請的鑒定或輔助鑒定病原的PCR引物對組合物中 這六種引物對的配比沒有要求，可以根據(jù)待鑒定病原的數(shù)量確定。
[0033] 所述rv和所述cdv組合使用時，組合在一起使用的各引物對的摩爾數(shù)相同。如這 兩種引物對組合在一起使用時，其摩爾比為1 :1。所述t〇x、所述lep、所述ichv和所述cpv 這四種引物對組合使用時，組合在一起使用的各引物對的摩爾數(shù)相同。如這四種引物對組 合在一起使用時，所述四種引物對的摩爾比為1 :1 :1 :1。
[0034] 本申請中，每種引物對中的兩條單鏈DNA的摩爾比均為1 :1。
[0035] 上述鑒定或輔助鑒定病原的PCR引物對組合物中，所述鑒定或輔助鑒定病原的 PCR引物對組合物，由所述rv、所述tox、所述lep、所述cdv、所述ichv和所述cpv這六種 PCR引物對中的五種、四種、三種、兩種或一種組成；
[0036] 所述病原為狂犬病病毒、弓形蟲、鉤端螺旋體、犬瘟熱病毒、犬傳染性肝炎病毒和 犬細(xì)小病毒這六種病原中的六種、五種、四種、三種、兩種或一種。
[0037] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定病原的成套試劑。
[0038] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定病原的成套試劑，由名稱為CRV的鑒定或輔助鑒 定狂犬病病毒的引物探針組合物、名稱為CTox的鑒定或輔助鑒定弓形蟲的引物探針組合 物、名稱為CLep的鑒定或輔助鑒定鉤端螺旋體的引物探針組合物、名稱為CCDV的鑒定或輔 助鑒定犬瘟熱病毒的引物探針組合物、名稱為CICHV的鑒定或輔助鑒定犬傳染性肝炎病毒 的引物探針組合物和名稱為CCPV的鑒定或輔助鑒定犬細(xì)小病毒的引物探針組合物組成；
[0039] 所述CRV