Bmp-6抗體的制作方法
【專利說明】BMP-6抗體
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及結(jié)合人BMP-6且可用于治療慢性 疾病的貧血（ACD)諸如癌癥的貧血或慢性腎病的貧血（CKD)的抗體或其抗原結(jié)合片段。
[0002] BMP-6是骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP)家族的成員；在BMP家族中存在多于20個(gè)成員。 BMP家族成員是起始SMAD途徑中的信號(hào)傳導(dǎo)從而導(dǎo)致細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的配體。BMP-6敲 除小鼠被報(bào)導(dǎo)為活的且可育的，并且顯示正常骨和軟骨發(fā)育，而密切相關(guān)的BMP-7的敲除 小鼠在出生后即死亡且伴隨腎、眼和骨缺陷。已顯示，BMP-6或BMP-7的單獨(dú)敲除不改變心 臟生成，但BMP-6和BMP-7的雙敲除確實(shí)顯示心臟的幾種缺陷和延遲，且胚胎由于心功能不 全而死亡。也已顯示，小鼠模型中BMP-7的存在在防止與纖維化相關(guān)的慢性心臟病的進(jìn)展 中是重要的。因此，當(dāng)用BMP-6抗體抑制人BMP-6時(shí)，針對(duì)BMP-7的交叉反應(yīng)性可能并不期 望。
[0003] 當(dāng)過度活化的炎性細(xì)胞因子引起鐵穩(wěn)態(tài)失調(diào)、紅細(xì)胞生成減少和紅細(xì)胞壽命減少 時(shí)，某些慢性疾病諸如癌癥、腎病和自體免疫病癥可導(dǎo)致ACD。已將鐵調(diào)素（Hepcidin)鑒定 為參與鐵穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵激素；高水平的鐵調(diào)素與見于ACD中的鐵限制性紅細(xì)胞生成相關(guān)。已 顯示BMP-6增加鐵調(diào)素表達(dá)。
[0004] WO 2010/056981公開在小鼠中施用針對(duì)人BMP-6產(chǎn)生的小鼠抗體；已報(bào)道，在使 用可購自R&D Systems的該小鼠抗體MAB507的三天方案后的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，鐵調(diào)素的減少 和鐵的增加。還公開針對(duì)BMP的選擇性，且顯示施用某些劑量的BMP-6抗體MAB507抑制 BMP-7。然而，迄今為止，沒有靶向BMP-6的抗體經(jīng)批準(zhǔn)用于治療應(yīng)用。
[0005] 仍需要提供替代性BMP-6抗體。具體而言，仍需要提供對(duì)BMP-6的選擇性高于對(duì)其 它BMP家族成員（包括BMP-7)的有效BMP-6抗體。也仍需要提供以下有效BMP-6抗體：其 對(duì)BMP-6的選擇性高于對(duì)其它BMP家族成員（包括BMP-7)且產(chǎn)生延長(zhǎng)的藥效動(dòng)力學(xué)反應(yīng)。 也仍需要提供以下有效BMP-6抗體：其對(duì)BMP-6的選擇性高于對(duì)其它BMP家族成員（包括 BMP-7)，其用于治療A⑶。
[0006] 因此，本發(fā)明提供結(jié)合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗體或其抗原結(jié)合片段，其 包含輕鏈可變區(qū)（LCVR)和重鏈可變區(qū)（HCVR)，其中LCVR包含互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R) IXDR1、 LCDR2 和 LCDR3,且 HCVR 包含 CDR HCDR1、HCDR2 和 HCDR3,其中 LCDR1 是多肽 RSSENIYRNLA (SEQ ID NO: 2)，LCDR2 是多肽 AATNLAD (SEQ ID NO: 3)，LCDR3 是多肽 QGIWGTPLT (SEQ ID NO: 4)，HCDR1 是多肽 GYTFTSYAMH (SEQ ID NO: 5)，HCDR2 是多肽 HNPYNDGTKYNENFKG (SEQ ID NO: 6)或HNPYNRGTKYNENFKG (SEQ ID NO: 7)，且HCDR3 是多肽 RPFGNAMDI (SEQ ID NO: 8)。
[0007] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗體或其抗 原結(jié)合片段，其包含輕鏈可變區(qū)（LCVR)和重鏈可變區(qū)（HCVR)，其中LCVR包含互補(bǔ)決定區(qū) (CDR) LCDR1、LCDR2 和 LCDR3,且 HCVR 包含 CDR HCDR1、HCDR2 和 HCDR3,其中 LCDR1 是多 肽 RSSENIYRNLA (SEQ ID NO: 2)，LCDR2 是多肽 AATNLAD (SEQ ID NO: 3)，LCDR3 是多肽 QGIWGTPLT (SEQ ID NO: 4)，HCDR1 是多肽 GYTFTSYAMH (SEQ ID NO: 5)，HCDR2 是多肽 HNPYNDGTKYNENFKG (SEQ ID NO: 6)，且 HCDR3 是多肽 RPFGNAMDI (SEQ ID NO: 8)。
[0008] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗體或其抗 原結(jié)合片段，其包含輕鏈可變區(qū)（LCVR)和重鏈可變區(qū)（HCVR)，其中LCVR包含互補(bǔ)決定 區(qū)（CDR) LCDR1、LCDR2 和 LCDR3,且 HCVR 包含 CDR HCDR1、HCDR2 和 HCDR3,其中 LCDR1 是 多肽 RSSENHRNLA (SEQ ID NO: 2)，LCDR2 是多肽 AATNLAD (SEQ ID NO: 3)，LCDR3 是多 肽 QGIWGTPLT (SEQ ID NO: 4)，HCDR1 是多肽 GYTFTSYAMH (SEQ ID NO: 5)，HCDR2 是多肽 HNPYNRGTKYNENFKG (SEQ ID NO: 7)，且 HCDR3 是多肽 RPFGNAMDI (SEQ ID NO: 8)。
[0009] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗體或其抗原 結(jié)合片段，其包含LCVR和HCVR，其中LCVR是多肽SEQ ID NO: 9,且HCVR是多肽SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1) 的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含LCVR和HCVR，其中LCVR是多肽SEQ ID NO: 9,且HCVR是 多肽SEQ ID NO: 10。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1) 的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含LCVR和HCVR，其中LCVR是多肽SEQ ID NO: 9,且HCVR 是多肽 SEQ ID NO: 11。
[0010] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗體，其包含 LCVR 和 HCVR，其中 LCVR 是多肽 SEQ ID NO: 9,且 HCVR 是多肽 SEQ ID NO: 10 或 SEQ ID NO: 11。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗體，其包 含LCVR和HCVR，其中LCVR是多肽SEQ ID NO: 9,且HCVR是多肽SEQ ID NO: 10。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗體，其包含LCVR和HCVR， 其中 LCVR 是多肽 SEQ ID NO: 9,且 HCVR 是多肽 SEQ ID NO: 11。
[0011] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗體，其包含 輕鏈（LC)和重鏈（HC)，其中LC是多肽SEQ ID NO: 12,且HC是多肽SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗體，其 包含LC和HC，其中LC是多肽SEQ ID NO: 12,且HC是多肽SEQ ID NO: 13。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，本發(fā)明提供結(jié)合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗體，其包含LC和HC，其中LC是多 肽 SEQ ID NO: 12,且 HC 是多肽 SEQ ID NO: 14。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗體，其包含 兩條輕鏈和兩條重鏈，其中每條輕鏈?zhǔn)嵌嚯腟EQ ID NO: 12,且每條重鏈?zhǔn)嵌嚯腟EQ ID NO: 13。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗體，其包含兩條 輕鏈和兩條重鏈，其中每條輕鏈?zhǔn)嵌嚯腟EQ ID NO: 12,且每條重鏈?zhǔn)嵌嚯腟EQ ID NO: 14。
[0013] 本發(fā)明還涉及編碼上述本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段的多核苷酸，所述多核苷酸 可呈RNA形式或呈DNA形式，該DNA包括cDNA和合成DNA。DNA可以是雙鏈或單鏈。編碼 本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段的編碼序列可由于遺傳密碼的冗余度或簡(jiǎn)并性而變化。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含編碼重鏈多肽的多核苷酸序列的DNA分子， 該重鏈多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO: 13或氨基酸序列SEQ ID NO: 14。在一個(gè)實(shí)施方 案中，本發(fā)明提供包含編碼輕鏈多肽的多核苷酸序列的DNA分子，所述輕鏈多肽具有氨基 酸序列 SEQ ID NO: 12。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 DNA分子，其包含編碼重鏈多肽的多核苷酸序 列，該重鏈多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO: 13;且包含編碼輕鏈多肽的多核苷酸序列，該 輕鏈多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO: 12。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 DNA分子，其 包含編碼重鏈多肽的多核苷酸序列，該重鏈多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO: 14;且包含編 碼輕鏈多肽的多核苷酸序列，該輕鏈多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO: 12。
[0016] 在所述序列可操作地連接至表達(dá)控制序列之后，本發(fā)明的多核苷酸將在宿主細(xì)胞 中表達(dá)。表達(dá)載體通?？勺鳛橛坞x基因體（印isome)或作為宿主染色體DNA的組成部分而 在宿主生物體中復(fù)制。通常，表達(dá)載體將含有選擇標(biāo)記（例如四環(huán)素（tetracycline)、新霉 素（neomycin)和二氫葉酸還原酶），以容許檢測(cè)用期望DNA序列轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞。
[0017] 本發(fā)