表達來自煙曲霉的葡糖淀粉酶的里氏木霉宿主細胞和其使用方法
【專利說明】表達來自煙曲霉的葡糖淀粉酶的里氏木霉宿主細胞和其使 用方法
[0001] 相關專利申請的交叉引用
[0002] 本專利申請要求2012年12月11日提交的國際專利申請no.PCT/CN2012/086349 的優(yōu)先權，并且其以引用方式整體并入本文。
[0003] 附件是包括SEQIDN0:1-14的序列表，其以引用方式整體并入本文。
技術領域
[0004] 本發(fā)明提供表達來自煙曲霉（Aspergillusfumigatus)的葡糖淀粉酶（AfGATR) 或其變體的里氏木霉（Trichodermareesei)宿主細胞，和其使用方法。
【背景技術】
[0005]淀粉由直鏈淀粉（15-30%重量/重量）和支鏈淀粉（70-85%重量/重量）的混 合物組成。直鏈淀粉由a-1，4_連接的葡萄糖單元的直鏈組成，分子量（MW)為約60, 000 至約800, 000。支鏈淀粉是每24-30個葡萄糖單元含有a-1，6分支點的支鏈聚合物；其MW 可能高達100, 〇〇〇, 〇〇〇。
[0006] 得自淀粉的、以濃縮右旋糖漿形式存在的糖目前通過酶催化法制備，所述方法涉 及：（1)用a-淀粉酶將固體淀粉液化（或降低粘度）成平均聚合度為約7-10的糊精，以 及（2)用葡糖淀粉酶（也稱為淀粉葡糖苷酶或GA)將所得的液化淀粉（即淀粉水解物）糖 化。所得的糖漿具有高葡萄糖含量。大部分商業(yè)生產的葡萄糖漿隨后通過酶法異構化為稱 為異糖漿（isosyrup)的右旋糖/果糖混合物。所得的糖漿也可用微生物（如酵母）發(fā)酵 以產生商品，包括例如乙醇、檸檬酸、乳酸、琥珀酸、衣康酸、谷氨酸一鈉、葡糖酸鹽、賴氨酸、 其他有機酸、其他氨基酸和其他生化物質。可同時進行發(fā)酵和糖化（即SSF工藝）來實現 更大的經濟性和效率。
[0007] 葡糖淀粉酶（葡聚糖1，4-a-葡糖水解酶，EC3. 2. 1. 3)是水解淀粉的外切碳水 化合物分解酶，其催化從淀粉或者相關低聚糖和多糖分子的非還原端去除連續(xù)的葡萄糖單 元。葡糖淀粉酶可以水解淀粉（例如，直鏈淀粉和支鏈淀粉）的直鏈和支鏈糖苷鍵。另一方 面，a-淀粉酶通過隨機裂解內部的a-1，4-糖苷鍵來水解淀粉、糖原和相關的多糖。葡糖 淀粉酶已被用于各種不同的目的，包括淀粉糖化、釀造、烘焙、用于食品工業(yè)的糖漿的生產、 用于發(fā)酵工藝的原料的生產以及用于動物飼料中來增加可消化率。
[0008] 葡糖淀粉酶由細菌、真菌和植物的許多菌株產生。例如，葡糖淀粉酶由煙曲霉 菌株產生。Luo等人，（2008)/'Productionofacidproofrawstarch-digesting glucoamylasefromanewlyisolatedstrainofAspergillusfumigatusMS-09從 煙曲霉MS-09的新分離菌株產生耐酸生淀粉消化的葡糖淀粉酶"），Sci.Tech.FoodIndus. (《食品工業(yè)科技》），29 (5): 151-154;Sellars等人，（1976)/'Degradationofbarley byAspergillusfumigatusFres"（ "利用煙曲霉Fres使大麥降解"），Proc.Int. BiodegradationSymp.(《國際生物降解研討會會刊》），第3版，S.J.Miles等人編輯，Appl. Sci.(《應用科學》），Barking,UK(英國巴金），第 635_43 頁；Domingues等人，（l"3)，"Productionofamylasebysoilfungiandpartialbiochemicalcharacterization ofamylaseofaselectedstrain(AspergillusfumigatusFresenius) "（ 通 過所選菌株（煙曲霉）的淀粉酶的土壤真菌和部分生物化學表征來產生淀粉酶"）， Can.J.Microbiol.(《加拿大微生物學雜志》），39 (7) : 681-85;Cherry等人，（2004)， "ExtracellularglucoamylasefromtheisolateAspergillusfumigatus"（"來自分 離煙曲霉的細胞外葡糖淀粉酶"），PakistanJ.Biol.Sci.(《巴基斯坦生物科學雜志》）， 7(11) :1988-92。然而，煙曲霉對于人類和植物具高度過敏性和致病性。因此，對于在制造 人類消費產品的工業(yè)方法中使用的葡糖淀粉酶而言，煙曲霉并非可行的生產宿主。有必要 從合適的宿主產生煙曲霉葡糖淀粉酶。

【發(fā)明內容】

[0009] 在里氏木霉中表達的來自煙曲霉的葡糖淀粉酶（AfGATR)在高溫和酸性pH下以較 長的時間催化糖化。提供了來自煙曲霉的已知葡糖淀粉酶（SEQIDN0:1和2)、編碼核酸 以及表達所述多核苷酸的里氏木霉宿主細胞的例子。里氏木霉宿主細胞相比于天然表達 的AfGA煙曲霉以更高或至少相當的水平表達AfGATR。AfGATR(包括AfGAlTR和AfGA2TR) 在高溫和低pH下表現出高活性，所以AfGATR在存在a-淀粉酶如白曲霉（Aspergillus kawachii)a-淀粉酶（AkAA)的情況下可有效地應用于糖化工藝中。與在煙曲霉中表達的 黑曲霉（Aspergillusniger)葡糖淀粉酶（AnGA)或天然AfGA催化的糖化產物相比，AfGATR 有利地催化淀粉糖化為顯著富集DPI(即，葡萄糖）的低聚糖組合物。AfGATR如AfGAlTR、 AfGA2TR或其變體能夠以比AnGA和天然表達的AfGA低的劑量使用，以生成相當水平的葡 萄糖。AfGATR或其變體可以與源自植物（例如，谷物和谷粒）的酶結合使用。AfGATR或 其變體還可以與宿主細胞分泌或宿主細胞內源的酶結合使用。例如，AfGATR或其變體可被 添加到糖化反應或SSF工藝，在所述工藝期間一種或多種淀粉酶、其他的葡糖淀粉酶、蛋白 酶、脂肪酶、植酸酶、酯酶、氧化還原酶、轉移酶或其他酶由生產宿主分泌。AfGATR或其變體 也可以與內源性非分泌型生產宿主酶組合在一起工作。在另一個例子中，AfGATR或其變體 可在糖化或SSF期間由生產宿主細胞與其他酶一起分泌。AfGATR葡糖淀粉酶或其變體可用 于如下工藝中，所述工藝涉及將淀粉直接水解為糖漿和/或生化物質（例如，醇類、有機酸、 氨基酸、其他生化物質和生物材料），其中反應溫度低于底物的糊化溫度。AfGATR或其變體 可在糖化或SSF期間由里氏木霉宿主細胞與其他酶一起分泌。
[0010] 因此，提供了一種表達AfGATR或其變體的重組里氏木霉宿主細胞，所述AfGATR或 其變體與SEQIDN0:12或13具有至少80%序列同一性，其中所述里氏木霉宿主細胞相比 于煙曲霉宿主細胞以相當水平表達AfGATR或其變體，所述煙曲霉宿主細胞在相同條件下 表達與AfGATR或其變體具有相同氨基酸序列的AfGA或其變體。
[0011] 還提供了一種表達AfGATR或其變體的重組里氏木霉宿主細胞，所述AfGATR或 其變體與SEQIDN0:12或13具有至少80%序列同一性，其中AfGATR或其變體相比于 與AfGATR或其變體具有相同氨基酸序列的AfGA或其變體是更加熱穩(wěn)定的，并且其中所述 AfGA或其變體在煙曲霉宿主細胞中表達。
[0012] 還提供了一種用于生產重組AfGATR或其變體的方法，其包括：（a)提供表達重組 AfGATR或其變體的里氏木霉宿主細胞，所述AfGATR或其變體與SEQIDN0:12或13具有 至少80%序列同一性；(b)在允許產生所述重組AfGATR或其變體的條件下培養(yǎng)所述宿主細 胞；和（c)分離所述重組AfGATR或其變體，其中所述AfGATR或其變體相比于與AfGATR或 其變體具有相同氨基酸序列的AfGA或其變體是更加熱穩(wěn)定的，并且其中所述AfGA或其變 體在煙曲霉宿主細胞中表達。
[0013] 還提供了一種由所公開的宿主細胞產生的重組AfGATR或其變體。所述重組 AfGATR或其變體在74°C下在pH5.0下10分鐘內可具有至少70%活性。所述重組AfGATR 或其變體可為AfGAlTR。所述AfGAlTR在55°C-74°C的溫度范圍內在pH5. 0下10分鐘內 可具有至少70 %活性。所述AfGAlTR可具有約68°C的最佳溫度。所述重組AfGATR或其變 體也可為AfGA2TR。所述AfGA2TR在61°C-74°C的溫度范圍內在pH5. 0下10分鐘內可具 有至少70%活性。所述AfGA2TR可具有約69°C的最佳溫度。所述重組AfGATR或其變體可 包含與SEQIDN0:12具有至少90%、95%或99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。所述 重組AfGATR或其變體可包含SEQIDN0:12。所述重組AfGATR或其變體還可由與SEQID NO: 13具有至少90%、95%或99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列組成。所述重組AfGATR 或其變體可由SEQIDNO: 12組成。所述重組AfGATR或其變體還可包含與SEQIDNO: 13 具有至少90%、95%或99 %氨基酸序列同一性的氨基酸序列。所述重組AfGATR或其變體 可包含SEQIDN0:13。所述重組AfGATR或其變體還可由與SEQIDN0:13具有至少90%、 95%或99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列組成。所述重組AfGATR或其變體可由SEQID NO: 13組成。
[0014] 還提供了一種糖化包含淀粉的組合物以產生包含葡萄糖的組合物的方法，其中所 述方法包括：（i)使淀粉組合物與根據權利要求4-15中任一項所述的分離的AfGATR或其 變體接觸；和（ii)糖化所述淀粉組合物以產生所述葡萄糖組合物；其中所述AfGAlTR或其 變體催化所述包含淀粉的組合物向包含葡萄糖的組合物的糖化。與由AnGA在相同條件下 制備的包含DPI的第二組合物相比，所述包含葡萄糖的組合物可富含DPI。與由野生型AfGA 在相同條件下制備的包含DPI的第二組合物相比，所述包含葡萄糖的組合物還可富含DPI。 所述AfGATR或其變體可為AfGATR2,并且所述包含葡萄糖的組合物與由AfGAlTR在相同 條件下制備的包含DPI的第二組合物相比可富含DPI。所述AfGAlTR或其變體的劑量可為 AnGA劑量的約40% -50%，以在相同條件下產生相同的DPI產率。
[0015] 此外提供，所述包含淀粉的組合物包含液化淀粉、糊化淀粉或顆粒淀粉。糖化可在 約30°C至約65°C的溫度范圍內進行。所述溫度范圍可為47°C_60°C。糖化可在pH2. 0-pH 6.0的pH范圍內進行。所述pH范圍可為pH3. 5_pH5. 5。所述pH范圍還可為pH4. 0_pH 5. 0〇
[0016] 此外提供，糖化方法還可包括使淀粉組合物與a-淀粉酶接觸。所述a-淀粉酶 可為AkAA。所述糖化方法還可包括使淀粉組合物與支鏈淀粉酶接觸。
[0017] 此外提供，所述糖化方法還可包括使所述葡萄糖組合物發(fā)酵以產生發(fā)酵最終 (EOF)產物。該發(fā)酵還可以是同時糖化和發(fā)酵（SSF)反應。該發(fā)酵可在pH2-8下并且 在25°C-70°C的溫度范圍內進行24-70小時。EOF產物可包含乙醇。該EOF產物可包含 8%-18% (v/v)的乙醇。所述方法還可包括使麥芽漿和/或麥芽汁與支鏈淀粉酶、a-淀 粉酶和AfGAlTR或其變體接觸。所述方法還可包括：(a)制備麥芽漿；(b)過濾所述麥芽漿 以獲得麥芽汁，和（C)使所述麥芽汁發(fā)酵以獲得發(fā)酵飲料，其中支鏈淀粉酶、a-淀粉酶和AfGAlTR或其變體被添加至：（i)步驟（a)的麥芽漿和/或（ii)步驟（b)的麥芽汁和/或 (iii)步驟（c)的發(fā)酵麥芽汁。該EOF產物可包含代謝物。該代謝物可以是檸檬酸、乳酸、 琥珀酸、谷氨酸一鈉、葡糖酸、葡糖酸鈉、葡糖酸鈣、葡