用于體外測試發(fā)育毒性的方法和系統(tǒng)的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2012年9月28日提交的新加坡專利申請第201207242-7號的權(quán)益， 其全部內(nèi)容通過引用并入本文。
技術(shù)領域
[0003] 本發(fā)明涉及用于發(fā)育毒性測試的方法和系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0004] 以下關(guān)于本發(fā)明【背景技術(shù)】的論述意在幫助對本發(fā)明的理解。但是，應當理解，在任 何司法管轄權(quán)中，在本申請的優(yōu)先權(quán)日，此論述不確認或不承認所涉及的任何材料是已發(fā) 表的、已知的、或者作為公知常識的一部分。
[0005] 先天缺陷是全世界新生兒死亡的主要原因之一 K2、3,其還會導致長期的殘疾和疾 病。胎兒發(fā)育期畸形可以歸因于遺傳條件或懷孕期間，特別是前三個月時的環(huán)境暴露。因 此，監(jiān)管部門，例如美國環(huán)境保護署（EPA)，已經(jīng)要求評價環(huán)境因素，例如藥物、化學品和殺 蟲劑的發(fā)育毒性4。
[0006] 在動物上測試發(fā)育毒性受成本和倫理問題的限制。因此，開發(fā)出一些替代性的基 于動物胚胎或細胞的體外發(fā)育模型，其包括青蛙胚胎畸形生長測定（FETAX)5,雞胚胎毒性 篩選測定（CHEST)6,使用小鼠胚胎間充質(zhì)細胞的微團（MM)測定7,小鼠或大鼠全胚胎培養(yǎng) (WEC)測定8,斑馬魚胚胎幼體發(fā)育毒性測定9,以及小鼠胚胎干細胞測試（EST)1(I。
[0007]根據(jù)歐洲替代方法驗證中心（ECVAM)，只有用于胚胎毒性測試的MM測定、WEC以及 小鼠EST是經(jīng)過科學驗證的，并可以考慮用于監(jiān)管性接受和可施用1h3。然而，物種間的差 異導致無法充分解釋人類和動物胚胎發(fā)育在分子調(diào)控上的差別，或者當用于生殖毒性測試 時，產(chǎn)生帶來災難性后果的假陰性結(jié)果。例如，被召回的藥物，沙利度胺，在人類中引起發(fā)育 畸形而在小鼠中不會 14。本技術(shù)的目的在于提供用于發(fā)育毒性研宄和篩選應用的基于人類 細胞的發(fā)育模型。
[0008] 雖然還未成功的開發(fā)出人類EST，但已經(jīng)開始嘗試使用人胚胎干細胞（hESC)代替 用于EST檢測的小鼠ESC16'17。小鼠EST的核心標準是基于對小鼠胚胎干細胞（mESC)分化 成跳動的心肌細胞的影響評價化合物的毒性1(1。使用小鼠ES細胞系D3和小鼠胚胎成纖維 細胞系3T3,它們嘗試測量兩個細胞系的細胞毒性抑制值（IC5(I)以及mESC的分化抑制值 (ID5CI)。進一步使用經(jīng)驗證的預測模型將藥物化合物分成三類，"無胚胎毒性"，"弱胚胎毒 性"和"強胚胎毒性"。整個過程持續(xù)10天，用傳統(tǒng)的在顯微鏡下的跳動的心肌細胞監(jiān)測，或 者持續(xù)7天使用FACS檢測心肌組織的基因表達。一個主要的原因是hESCs以緩慢的速率 在體外分化成心肌細胞，較mESCs更耗時（30天后達10-25 % )18,這使得不可能在第10天 對跳動的心肌細胞計數(shù)。使用RT-PCR或免疫染色法，研宄人員可以獲取描述發(fā)育毒素作用 的數(shù)據(jù)。然而，缺少合適的評分系統(tǒng)使其在藥物測試應用中仍不令人滿意。
[0009] 2010年，Cezar的團隊使用代謝組學和隨機森林模型，首次成功將藥物分類為發(fā) 育毒素和非發(fā)育毒素19。然而，他們僅在hESC多潛能維持培養(yǎng)基（例如mTeSRl培養(yǎng)基）中 測試了那些藥物而沒有在實際分化的hESC中測試，并且由于僅在實驗中使用流傳的濃度 的藥物，他們未能將那些發(fā)育毒素進一步分類為弱或強發(fā)育毒性化合物。
[0010] 目前基于細胞的麗和EST測定可以潛在地包括人胚胎的細胞或者多潛能的細胞， 但是在這些模型中，發(fā)育過程（例如細胞分化成3個胚層）是自發(fā)且無序的。因此，它們沒 有提供靈敏并可靠的分類發(fā)育毒素的方式，所述發(fā)育毒素包括胚胎毒素和致畸物，因為所 述測定測量一般的細胞毒性 7或心肌組織形成的抑制程度1(1，其太粗糙以致無法獲取發(fā)育 毒性的重要方面-分化圖案的干擾。目前的EST模型依靠外源物作為發(fā)育毒性指示劑測量 心肌細胞形成的抑制。因此它無法與hESC的固有性質(zhì)相兼容，因為hESC無法像小鼠ES細 胞一樣容易地形成心肌細胞。
[0011] 本發(fā)明的目的是改善此處提到的至少一個問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 在整個文件中，除非有另外相反的陳述，術(shù)語"包含"、"包括"等表述理解為非窮盡 性列舉，或換句話說，是指"包括但不限于"。
[0013] 本技術(shù)包括一種體外測試發(fā)育毒性的方法，其包括以下步驟：
[0014] a.微圖案化細胞外基質(zhì)；
[0015] b.在存在中內(nèi)胚層誘導培養(yǎng)基的情況下，使胚胎干細胞在微圖案化細胞外基質(zhì)上 生長，以形成幾何形狀的中內(nèi)胚層結(jié)構(gòu)；以及
[0016] c.在存在或不存在測試化合物的情況下，測試幾何形狀的中內(nèi)胚層結(jié)構(gòu)的變化， 其中，與不存在測試化合物的細胞相比，在存在測試化合物的情況下，（1)中內(nèi)胚層細胞分 化減少和/或（2)幾何形狀的中內(nèi)胚層結(jié)構(gòu)的形態(tài)學變化表明測試化合物是發(fā)育毒性劑。
[0017] 中內(nèi)胚層誘導劑用于模擬一種早期胚胎發(fā)育過程（原條形成）。這種方法的優(yōu)點 可能是有多于一個發(fā)育毒性作用的定量描述符。
[0018] 參考以下提及的優(yōu)選實施方式的說明性附圖，回顧后面的說明書，本領域技術(shù)人 員清楚本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點。
【附圖說明】
[0019] 本發(fā)明的優(yōu)選實施方式將參考下述附圖，僅以說明性實例的方式描述：
[0020] 圖1 :用聚二甲基硅氧烷（PDMS)模板使細胞圖案化。
[0021] 圖2 :分化3天后形成與hESC集落形狀相同的幾何形狀的中內(nèi)胚層結(jié)構(gòu)。（a)、 (b)、（e)、（f)是面積為 785000ym2 的hESC集落；（c)、（d)是面積為 196250ym2hESC集落。 紅色：中內(nèi)胚層標記物Brachyury的免疫焚光染色；比例尺：200ym。
[0022] 圖3 :共焦掃描hESC集落的邊緣（圓形）。紅色：Brachyury，藍色：DAPI。（a) 3-D 重建顯示Brachyury陽性細胞位于hESC集落的邊緣，形成閃亮的"環(huán)形物";(b)Z堆疊表明 Brachyury陽性細胞僅位于細胞片層的頂層，并且在閃亮的"環(huán)形物"下方有"管狀"結(jié)構(gòu)。 比例尺：30ym。
[0023] 圖4 :在藥物處理/無藥物處理的條件下，分化3天后Brachyury的表達情況。用 5-氟尿嘧啶（5-FU) (b)，丙戊酸（VPA) (c)或沙利度胺（d)處理后，T表達錯誤定位。比例 尺：100ym〇
[0024] 圖5:非對稱比例計算。首先使用未處理的hESC集落獲得環(huán)（a)&b)中的紅色）的 半徑，然后用這個環(huán)作為經(jīng)致畸劑處理的hESC集落的遮蓋物（c)，分別計算兩種非對稱比 例并比較相對變化。
[0025] 圖6:相對于未處理的對照，致畸劑誘導發(fā)生的非對稱比例變化。a)致畸劑處理或 無致畸劑處理的非對稱比例值。b)與未處理對照組相比，致畸劑處理后的相對非對稱比例 變化。0. 05μg/ml5-FU的非對稱比例下降了 46. 7%，從3降至1.6 ;0.ImM丙戊酸和0. 8mM 沙利度胺的不對稱比例下降了 70%，從3降至~0. 9。
[0026] 圖7:微圖案化的不同hESC細胞系形成的幾何形狀的中內(nèi)胚層結(jié)構(gòu)的圖像。（A): 分化3天后微圖案化的H9hESC。（B)分化3天后微圖案化的HlhESC。
[0027] 圖8:通過空間圖案化分化然后協(xié)調(diào)的形態(tài)發(fā)生性細胞運動形成幾何形狀的中內(nèi) 胚層結(jié)構(gòu)。（A)第1天至第3天（D1-D3)微圖案化的hESC(yp-hESC)集落的相位和熒光圖 像。中內(nèi)胚層（T+)細胞第1天在集落邊緣空間圖案化，然后在第3天從展示為距集落邊緣~ 150-200ym。（B)分化3天后其他中內(nèi)胚層標記物的空間圖案化。Wnt3a、Fgf8、Criptol(綠 色）與T(紅色）共定位于yP-hESC集落中。（C)上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT)標記物在 yP-hESC集落的邊緣和中心周圍的轉(zhuǎn)錄水平。與集落中心的細胞相比，yP-hESC集落邊 緣附近的細胞具有更高的諸如Snail和波形蛋白的EMT標記物表達水平。Brachyury(T)、 Wnt3a、Fgf8和Criptol全部是中內(nèi)胚層標記物。（D)在10X物鏡下的yP-hESC集落3天 活體成像的拼集的照片顯示3天分化過程中細胞運動。（E)在3天活體成像窗口中沿著圖 1D上的集落的黃線進行的波動曲線記錄圖分析。集落邊緣附近的細胞顯示在第2天出現(xiàn)隨 機細胞迀移，但是在第3天經(jīng)歷了定向的集合性細胞運動。
[0028] 圖9:發(fā)育毒性藥物影響yP-hESC模型中中內(nèi)胚層結(jié)構(gòu)的物理形態(tài)學/位置。 (A):藥物處理的yP-hESC集落的波動曲線記錄圖。發(fā)育毒性藥物處理（沙利度胺&VPA) 下的集合性細胞迀移軌跡在第2-3天受到干擾，而在非發(fā)育毒性藥物處理（青霉素G)下的 集合性細胞迀移未受影響。（B):有/沒有藥物處理的情況下，中內(nèi)胚層標記物T在第3天 的位置。當使用沙利度胺或VPA處理時，中內(nèi)胚層圖形（T+區(qū)域）的位置發(fā)生錯位，然而使 用陰性對照藥物青霉素G時保持不變。比例尺：100ym。
[0029] 圖10 :發(fā)育毒性藥物引起的劑量依賴性發(fā)育毒性應答的PCA結(jié)果。（A-C):當使用 視黃酸（狀，>=〇.〇〇36以/1111)、沙利度胺（>=30〇1^)或￥?六（>=0.81111)處理時，顯 著干擾uP-hESC集落內(nèi)的中內(nèi)胚層圖形的空間分布。（D):即使?jié)舛冗_到1000 μg/ml時， 青霉素G藥物處理也不能顯著干擾yP-hESC集落內(nèi)的中內(nèi)胚層圖形的空間分布。
[0030] 圖11 :基于PCA和細胞毒性測試（MTS)結(jié)果的藥物分類結(jié)果。（A)RA的有效濃度 (能顯著干擾yP-hESC模型中的中內(nèi)胚層圖形的空間位置的最低藥物濃度）（ecka)是~ 0. 0036yg/ml，