以及A ; 位置T332處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：S、M、C、Y、K、Q、R以及A ; 位置T296處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：T、D、E、Y、N、F、K、W、A、S以及L ; 位置N49處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：M、Q、L、G、E、D、A、S以及P ; 位置Y493處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：E、K、N、D、I、A、V以及F ; 位置S196處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：D、V、E、F、A、K、G、R、L、P、M以及 I ; 位置G430處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：N、Q、S、A、R、L、M、C、D、I以及T ; 位置T246處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：K、L、M、E、W、N、R、I、Q、T、F、P以 及S ; 位置Y247處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：Q、T、M、W、D以及F; 位置N307處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：E、R、A、C、D以及H; 位置T356處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：M、I以及L; 位置Y466處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：R、C、V以及S; 位置S357處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：A、G、T、R以及V; 位置Q27處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：A、E、K、V、T以及I; 位置S387處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：K、I、W、G、D、V以及A; 位置L318處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：1、V以及C; 位置T389處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：S、H、V以及D; 位置Y303處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：W、L以及F; 位置Y370處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：R、Q、L、G以及F; 位置K287處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：E、Y、D以及N; 位置T285處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：R、C、K以及Q; 位置N350處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：K、D、Q、L以及I; 位置D249處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：A、Q以及S; 位置F338處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：D、L以及R; 位置S113處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：G、E、N以及T; 位置Y492處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：M、H、A以及F; 位置S398處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：A、D以及P; 位置T226處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：G、A、C、D、V以及S; 位置Y371處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：Y以及W; 位置A316處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換以及C; K346H氨基酸置換； G340D氨基酸置換； S342C氨基酸置換； D368C氨基酸置換； M374C氨基酸置換； E236D氨基酸置換； 位置Y474處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：K以及W; G391Y氨基酸置換； F418Y氨基酸置換； 位置F311處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：Y和V; R251A氨基酸置換； T281D氨基酸置換； 位置V104處的選自以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換：F和H; L326I氨基酸置換； A224Q氨基酸置換； E385Y氨基酸置換； 以及其任何組合。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的分離的變體，其中所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQID NO:3的S92和T41之一或兩個(gè)氨基酸位置處還包含另外的氨基酸突變。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的變體，其中所述另外的氨基酸突變?yōu)檫x自以下各項(xiàng)組 成的組的氨基酸置換：S92T、T41I，以及S92T與T41I兩者。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的分離的變體，其中所述親本CBH多肽為真菌纖維 二糖水解酶I (CBHl)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的分離的變體，其中所述真菌CBHl是來自紅褐肉座菌 (Hypocrea jecorina)、施韋尼茲肉座菌（Hypocrea schweinitzii)、東方肉座菌（Hypocrea orientalis)、擬康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)、康長(zhǎng)木霉(Trichoderma konilangbra)、桔綠木霉(Trichoderma citrinoviride)、哈茨木霉(Trichoderma harzanium)、棘抱曲霉（Aspergillus aculeatus)、黑曲霉（Aspergillus niger)、微紫青霉 菌（Penicillium janthinellum)、灰腐質(zhì)霉（Humicola grisea)、嗜熱色串抱（Scytalidium thermophilum)或柄抱霉（Podospora anderina) 〇
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的分離的變體，其中所述親本CBH多肽與SEQ ID N0:3具有至少90%的序列同一性。
10. -種分離的多核苷酸，其包含編碼根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的親本CBH多 肽變體的多核苷酸序列。
11. 一種載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求10所述的分離的多核苷酸。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的載體，其中所述載體為表達(dá)載體。
13. -種宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求10所述的分離的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求11 所述的載體或根據(jù)權(quán)利要求12所述的表達(dá)載體。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為真菌細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞選自由以下各項(xiàng)組成的組： 絲狀真菌細(xì)胞，其選自以下各項(xiàng)組成的組：里氏木霉（Trichoderma reesei)、長(zhǎng)枝 木霉(Trichoderma Iongibrachiatum)、綠色木霉(Trichoderma viride)、康寧木霉 (Trichoderma koningii)、哈茨木霉、青霉屬（Penicillium)、腐質(zhì)霉屬（Humicola)、特異腐 質(zhì)霉（Humicola insolens)、灰腐質(zhì)霉（Humicola grisea)、金抱子菌屬（Chrysosporium)、 魯克文金抱子菌（Chrysosporium lucknowense)、嗜熱毀絲菌（Myceliophthora thermophila)、粘帚霉屬（Gliocladium)、曲霉菌屬（Aspergillus)、鏡抱屬（Fusarium)、 脈胞菌屬（Neurospora)、肉座菌屬（Hypocrea)、翹孢霉屬（Emericella)、黑曲霉、泡 盛曲霉（Aspergillus awamori)、棘抱曲霉和構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans);酵 母細(xì)胞，其選自以下各項(xiàng)組成的組：釀酒酵母（Saccharomyces cervisiae)、裂殖酵母 (Schizzosaccharomyces pombe)、西方許旺酵母（Schwanniomyces occidentalis)、乳 酸克魯維酵母（Kluveromyces Iactus)、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis)、白假絲酵母 (Candida albicans)、具柄畢赤酵母（Pichia stipitis)、畢赤酵母（Pichia pastoris)、 解脂耶羅威亞酵母（Yarrowia lipolytica)、多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha)、紅 發(fā)夫酵母（Phaffia rhodozyma)、Arxula adeninivorans、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii)和多形德巴利酵母（Debaryomyces polymorphus);以及 運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis)細(xì)菌細(xì)胞。
16. 根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞表達(dá)由所述分 離的多核苷酸、載體或表達(dá)載體編碼的親本CBH多肽變體。
17.-種產(chǎn)生變體CBH多肽的方法，其包括在產(chǎn)生所述變體的合適培養(yǎng)基中和合適條 件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求16所述的宿主細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其進(jìn)一步包括分離所述產(chǎn)生的變體。
19. 一種洗滌劑組合物，其包含表面活性劑和根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的變體 CBH多肽。
20. -種飼料添加劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的變體CBH多肽。
21. -種用于水解纖維素底物的方法，其包括： 使所述底物與根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的分離的變體CBH多肽相接觸； 使所述底物與根據(jù)權(quán)利要求16所述的宿主細(xì)胞相接觸； 或兩者的組合。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述纖維素底物具有選自以下各項(xiàng)組成的組的 木質(zhì)素纖維素生物質(zhì)：草、柳枝稷、繩草、黑麥草、草蘆、芒草、糖加工殘余物、甘蔗渣、農(nóng)業(yè)廢 物、稻草、稻殼、大麥秸、玉米芯、谷草、小麥秸、油菜秸、燕麥秸、燕麥殼、玉米纖維、稿桿、大 豆桿、玉米桿、林業(yè)廢物、木漿、循環(huán)利用的木漿纖維、造紙污泥、鋸肩、硬木材、軟木材和其 組合。
23. -種細(xì)胞培養(yǎng)上清液，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的CBH變體。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)上清液來自根據(jù)權(quán)利 要求16所述的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，其進(jìn)一步包含一種或多種另外的纖 維素酶或半纖維素酶。
26. -種產(chǎn)生包含CBH變體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液的方法，所述方法包括： 在表達(dá)所述CBH變體的合適條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求16所述的宿主細(xì)胞；以及 收集所述培養(yǎng)物的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，進(jìn)而產(chǎn)生包含所述CBH變體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟中的一個(gè)或多個(gè)： 在所述培養(yǎng)步驟之后殺死所述宿主細(xì)胞； 過濾所述收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液以去除細(xì)胞碎片；以及 使所述細(xì)胞培養(yǎng)上清液經(jīng)受超濾或其他步驟以富集或濃縮所述CBH變體。
28.根據(jù)權(quán)利要求26或27所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞進(jìn)一步表達(dá)一種或多種另外 的纖維素酶和/或半纖維素酶，其中所述一種或多種另外的纖維素酶和/或半纖維素酶存 在于所述細(xì)胞培養(yǎng)上清液中。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述一種或多種另外的纖維素酶和/或半纖維 素酶被外源性表達(dá)在所述宿主細(xì)胞中、內(nèi)源性表達(dá)在所述宿主細(xì)胞中、與所述細(xì)胞培養(yǎng)上 清液混合，或其組合。
30.根據(jù)權(quán)利要求26至29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括使所述細(xì)胞 培養(yǎng)上清液與木質(zhì)素纖維素生物質(zhì)底物相接觸。
【專利摘要】本發(fā)明公開了紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)Cel7A(原為里氏木霉(Trichoderma reesei)纖維二糖水解酶I或CBH1)的許多同源物和變體，編碼其的核酸以及其產(chǎn)生方法。所述同源物和變體纖維素酶具有家族7A的糖基水解酶的氨基酸序列，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被置換和/或缺失。
【IPC分類】C12N9-42
【公開號(hào)】CN104870644
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380064542
【發(fā)明人】R·R·博特, M·?？ɡ? R·霍梅斯, T·卡佩爾, B·R·凱萊門, S·克拉利, I·尼古拉耶夫, M·桑德格倫, 里朔特 J·范, 斯提格 桑斯 S·范
【申請(qǐng)人】丹尼斯科美國(guó)公司
【公開日】2015年8月26日
【申請(qǐng)日】2013年12月10日
【公告號(hào)】CA2892786A1, WO2014093275A1